Способ получения иммобилизованного @ -химотрипсина

Способ получения иммобилизованного @ -химотрипсина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии , в частности к иммобилизации с -химотрипсина для получения стабильных и активных препаратов этого фермента . Цель изобретения - повышение содержания иммобилизованного /-химотрипсина в расчете на 1 г носителя. Способ заключается в введении Дополнительной стадии - гидроксилирования силохрома 10-15%-ной соляной кислотой в аппарате Сокслета, которую проводят перед обработкой силокрома парами тетрахлорида титана и водой и адсорбцией фермента. Гидроксилирование проводят для увеличения содержания гидроксильных групп до 0,8-1,1 ммоль на 1 г носителя. Содержание фермента на носителе возрастает л/в 2 раза. 9

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

7 .5

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ/ ", к двтсн ском Св тепьСтвМ (21) 4136790/28-13 (22) 21. 10.86 (46) 30.06.88. Бюл. И - 24 (71) ЛГУ им. А.А.Жданова (72) И.М:Гиманова и В.Н.Постнов (53) 577.15(088.8) (56) Ямсков И.А. и др. Биоорганическая химия, 1980, т. 6, II- 9, с. 14041407.

Авторское свидетельство СССР

У 982782, кл. В 01 J 20/10, 1981. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОГО e(--XHMOTPHIICHHA (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к иммобилизации г

„„SU„„3406162 А 1 (51)4 С f2 N 11/14 //В 01 J 20 10 Ы-химотрипсина для получения стабильных и активных препаратов этого фермента. Цель изобретения — повьппение содержания иммобилизованного c(-химотрипсина в расчете на 1 r носителя.

Способ заключается в введении Дополнительной стадии — гидроксилирования силохрома 10-15Х-ной соляной кислотой в аппарате Сокслета, которую проводят перед обработкой силохрома парами тетрахлорида титана и водой и адсорбцией фермента. Гидроксилирование проводят для увеличения содержания гидроксильных групп до 0,8-1, 1 ммоль на 1 r носителя. Содержание фермента на носителе возрастает в 2 раза.

1406162

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к иммобилизации, -химотрипсина для получения стабильных и активных препаратов этого фер5 мента.

Цель изобретения — повышение содержания иммобилизованного а -химотрипсина в расчете на 1 r носителя.

Способ заключается в введении дополнительной стадии обработки силохрома — гидроксилирования, которую проводят перед обработкой силохрома парами тетрахлорида титана и водой.

Гидроксилирование осуществляют 15207-ным раствором соляной кислоты в воде с помощью аппарата Сокслета. После гидроксилирования в силохроме увеличивается содержание гидроксильных групп до 0,8-1,1 ммоль на 1 г но-20 сителя.

В реакцию гидроксилирования вступают силоксановые связи силохрома, как правило, менее активные в поверхностных реакциях, чем силанольные., Использование в качестве катализатора соляной кислоты обеспечивает более эффективное течение реакции с образованием переходного комплекса, чем при использовании других неорганических кислот, поскольку сравнительно малые геометрические молекулы

НС1 позволяют осуществлять транспорт реагента к трудно доступным участкам поверхности, кроме того, под действием соляной кислоты происходит большая 35 протонизация поверхности, в результате образуются дополнительные силанольные группы — центры хемосорбции тетрахлорида титана, воды и ферментов.

Содержание иммобилизованного фермента при применении предлагаемого способа возрастает: в 2 раза.

Пример 1. 2 г силохрома обрабатывают хлороформом в аппарате Сок45 слета в течение 5 ч. После этого образец тщательно высушивают и обрабатывают в аппарате Сокслета 15X — ным раствором соляной кислоты в воде в течение 4 ч при 100 С. Далее образец промывают водой до отсутствия кислой реакции в промывных водах и сушат при 200 С. Концентрация ОН-группы на поверхности составляет 1, 1 ммоль/г.

Образец обрабатывают парами четыреххлористого титана в течение 3 ч при

180 С в токе осушенного газа-носителя (воздух, аргон). Затем в течение

2 ч проводят удаление непрореагировавших паров четуреххлористого титана и хлористого водорода, после чего продукт обрабатывают парами воды в течение 4 ч.

Адсорбцию / -химотрипсина проводят из раствора фермента в фосфатном буфере (концентрация фермента 5 мг/мл) в течение 2 ч, после чего образец промывают фосфатным буфером и раствором хлорида калия (0,1 И). Концентрация адсорбированного a -химотрипсина составляет 45,7 мг/г.

При проведении процесса адсорбционной иммобилизации соотношение белок/носитель составляет 75 мг белка на 1 r носителя. Объем введенного в реакционную смесь белка 225 мг, степень связывания белка при проведении процесса р = 0„63.

Протеолитическая активность нативного и иммобилизованного o(-химотрипсина в реакции протеолиза гемоглобина, определенная по методу Ансона, составляет соответственно 517 и

388 Е/r. Таким образом, полученный гетерогенный катализатор сохраняет большую часть исходной активности (752), что является высоким показателем для катализаторов такого типа.

Пример 2. Получение 3 r силохрома, содержащего на поверхности оксид титана, проводят по примеру 1, Адсорбцию Ы-химотрипсина проводят из раствора фермента в фосфатном буфере, исходная концентрация фермента

4,5 мг/мл, соотношение белок/носитель составляет 67 мг фермента на

1 r носителя, общее содержание фермента в растворе 200 мг. Процесс.адсорбции проводят в течение 2 ч, после чего образец промывают фосфатным буфером и раствором калий хлор (О, 1 М). Концентрация адсорбированного a -химотрипсина составляет

30 мг/г, степень связывания фермента в данном случае p = 0,45. При концентрации фермента в растворе менее

5 мг/мл .достижение положительного эффекта невозможно.

Пример 3. Получают 3 г силохрома с титаноксидным слоем на поверхности по примеру 1.

При проведении адсорбции c(-химотрипсина концентрация исходного раствора фермента в фосфатном буфере составляет 7 мг/мл, т.е. 101 мг белка на 1 г носителя при общем объеме белка в растворе 303 мг. После 2-ча3 14061 совой сорбции I --химотрипсина образец промывают 0,1 M КС1. Концентрация адсорбированного фермента составляет

45,8 мг/г, p = 0,45. Уменьшение степени связывания фермента в данном случае по сравнению с условиями иммобилизации примера 1 показывает неце- . лесообразность увеличения концентрации белка в исходном растворе выше >р

5 мг/мл и соотношения белок/носитель выше 75 мг на 1 г носителя.

Пример 4. 3 r силохрома обрабатывают хлороформом в аппарате Сокслета в течение 5 ч. После сушки об- 15 разца при 200 С определяют исходное количество гидроксильных групп поверхности — 0,6 ммоль/г. После проведенного синтеза титаноксидного слоя и адсорбции o(-химотрипсина (по примеру 1) определяют концентрацию иммобилизованного фермента — 24 мг/г, степень связывания в этом случае

0,32. Стадия гидроксилирования относится к существенным отличитель- 25 ным признакам предложенного решения, так как ее исключение (в данном примере) не позволяет достигнуть положительного эффекта.

Пример 5. 3 г силохрома обра- 30 батывают хлороформом в аппарате Сокслета в течение 5 ч. После этого образец просушивают и обрабатывают в аппарате Сокслета 8 .-ным раствором

НС1 в течение 4 ч при 100 С. Образец р 35 промывают водой и сушат при 200 С.

Концентрация ОН-групп на поверхности составляет 0,7 ммоль/г. После проведения синтеза титаноксидного .слоя и адсорбции -химотрипсина получают катализатор, содержащий на поверхности фермент 30 мг/г. Степень связывания фермента P = 0,40.

Пример 6. 3 r силохрома обра- 45 батывают хлороформом в течение 5 ч.

После этого образец просушивают и обрабатывают 15 -ным раствором H

62

При гидроксилировании поверхности силохрома раствором Н ЯО применение аппарата Сокслета невозможно, поскольку серная кислота нелетуча. Использование раствора серной кислоты на стадии гидроксилирования не приводит к достижению положительного эффекта изобретения.

Пример 7. 3 r силохрома обрабатывают в аппарате Сокслета хлороформом в течение 5 ч. После просушки образец обрабатывают в аппарате Сокслета раствором НС1 в течение 2 ч при

100 С. Концентрация ОН-групп на поверхности составляет 0,7 мг/г.

Синтез титаноксидного слоя и адсорбцию с(-химотрипсина проводят по примеру 1. Концентрация белка на поверхности 29 мг/г, = 0,39.

Пример 8. 3 r силохрома обрабатывают хлороформом в аппарате Сокслета в течение 5 ч 15 -ным раствором

НС1 промывают, сушат при 200 С и проводят модификацию поверхности

TiC14, водой и раствором a -химотрипсина по примеру 1. Концентрация OHгрупп на поверхности 1, 1 ммоль/г, гетерогенный катализатор содержит фермента 45,8 мг/г,- /3 = 0,63.

Пример 9. 3 г силохрома обрабатывают хлороформом в аппарате Сокслета в течение 5 ч. После просушки образец помещают в 1Ж-ный раствор соляной кислоты на 4 ч при 70 С в во" дяной бане. Образец промывают водой и сушат при 200 С. Концентрация ОНгрупп на поверхности 0,7 ммоль/г.

После этого проводят синтез титаноксидного слоя и адсорбцию a(-химотрипсина по примеру 1. Концентрация фермента на поверхности составляет

28,8 мг/г, P= 0,39. Проведение стадии гидроксилирования целесообразно при 100 С, лишь в этом случае можно достигнуть положительного эффекта изобретения.

Аппарат Сокслета позволяет проводить интенсивную обработку дисперсного образца, имеющего большую удельную поверхность, потоком свежеперегйанного раствора.

Испарительная колба, содержащая раствор НС1, соединяется с холодильником, в котором происходит конденсация раствора, немедленно попадаю.щего на образец, находящийся в промывной емкости на пористом фильтре.

При достижении определенного уровня

1406162

Составитель В.Муронец

Техред А.Кравчук Корректор И.Эрдейи

Редактор Н.Киштулинец

Заказ 3157/23

Тираж 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 в емкости весь раствор вновь стекает в испарительную колбу.

Гидроксилирование образца в àïïàрате Сокслета идет в динамическом режиме.

Пример 10. Способ получения иммобилиэованного протеолитического фермента отличается от способа по примеру 1 тем, что на стадии гидроксилирования поверхности используют

10Х-ный раствор соляной кислоты. В этом случае концентрация ОН-групп на поверхности составляет 0,8 ммоль/г, а концентрация адсорбированного

Ы-химотрипсина на поверхности 32,6 мг/

/r носителя, Пример 11. Способ получения иммобилизованного протеолитического фермента отличается от способа по примеру 1 тем, что на стадии гидроксилирования поверхности используют

20Х-ный раствор соляной кислоты. В этом случае концентрация ОН-групп на поверхности 1, 1 ммоль/г, а концентрация адсорбированного -химотрипсина

45,7 мг/г носителя.

Таким образом, использование изобретения позволяет значительно увеличить содержание иммобилизованного

0(-химотрипсина в расчете на 1 г носителя — от 24 до 32-46 мг/г при высокой степени связывания (0,63 против

0,32) и при сохранении высокой удельной активности в расчете на 1 г носителя (около 757). формула изобретения

Способ получения иммобилизованного

o(-химотрипсина, включающий обработку силохрома четыреххлористым титаном и водой, адсорбцию фермента на модифи-... цированном силохроме и промывку целевого продукта буферным раствором, отличающийся тем, что, с целью повышения содержания иммобилиО зованного -химотрипсина в расчете на 1 r носителя, перед обработкой четыреххлористым титаном силохром гидроксилируют 10-15Х-ным раствором со25 ляной кислоты до достижения содержания гидроксильных групп 0,8-1,1ммоль на 1 r носителя.