Способ получения иммобилизованной холинэстеразы

Способ получения иммобилизованной холинэстеразы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к области биохимии, биотехнологии и предназначено для получения высокоактивных и термостабильных препаратов иммобилизованной холинэстеразы. Указанные препараты.иммобилизованной холинэстеразы могут быть использованы в устройствах для контроля степени загрязнения воздуха и т.д. Цель изобретения - увеличение удельной активности целевого продукта и выхода фермента при иммобилизации. Способ заключается в связывании фермента с хлорангидридным производным сштохрома C-80j полученного из карбоксильного производного силохрома С-80 при нагревании последнего с хлористым тионилом в смеси: 2 мл хлористого тионила, 0,2 мл диметилформамида и 15 мл абсолютированного хлороформа. В процессе иммобилизации в течение 1 ч 12-220 мг белка на 1 г носителя с носителем связывается 45% активности, 55,50% белка; емкость носителя 8,6 мг/г; удельная активность препарата иммобиттизованной холинэстеразы 27,6 ед./г носителя.При хранении в условиях комнатной температуры активность препарата иммобилизованной холинэстеразы .сохранялась в течение 80 дней. i (Л

СОЮЗ СОВЕТ((ИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (11) (5g 4 С 12 N 11/14

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИд

Н A8TOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 4023385/31-13 (22) 17.02.86 (46) 15.07.88. Бюл. N - 26 (71) Институт физиологически активных веществ АН СССР (72) Е.Г. Киреева, Л.И. Зудинова и P.Ñ. Агабекян (53) 577.25 (088.8) (56) Иммобнлизованные ферменты/Под ред. И.В, Березина и др. М., МГУ, т. 2, 1976, с. 276 °

Kovas Kamil.la, Szajani Bela. Immobilizalt kolineszteraz eloallitasa, Nagyar Kemiai Folyoirat, 88; evf 1982

9 sz, 429-431. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ХОЛИН ЭСТЕРАЗЫ (57) Изобретение относится к области биохимии, биотехнологии и предназначено для получения высокоактивных и термостабильных препаратов иммобилизованной холинэстеразы. Указанные препараты иммобилизованной холинэстеразы могут быть использованы в устройствах для контроля степени загрязнения воздуха и т.д. Цель изобретения— увеличение удельной активности целевого продукта и выхода фермента при иммобилизации. Способ заключается в связывании фермента с хлорангидридным производным силохрома С-80, полученного из карбоксильного производного силохрома С-80 при нагревании последнего с хлористым тионилом в смеси: 2 мл хлористого тионила, 0,2 мл диметилформамида и 15 мп абсолютированного хлороформа. В процессе иммобилизации в течение 1 ч 12-220 мг белка на 1 г носителя с носителем связывается 45% активности, 55,50% белка; емкость носителя 8,6 мг/г; удельная активность препарата иммобилизованной холинэстеразы 27,6 ед./г носителя. При хранении в условиях комнатной температуры активность препарата иммобилизованной холинэстеразы сохранялась в течение 80 дней.

1409656

Изобретение относится к биохиии, биотехнологии и предназначено для получения высокоактивных и термостабильных препаратов иммобилизованной, холинэстеразы, которые могут найти применение в устройствах для контроля степени загрязнения воздуха, водоемов и рек ингибиторами холинэстераз, производными карбаминовой кислоты и фос- 10 форорганическими соединениями, широко применяемыми в сельском хозяйстве в качестве пестицидов, Цель изобретения — увеличение активности иммобилизованной холинэсте. — 15 разы и выхода фермента при иммобилизации, Способ осуществляется следующим об. разом.

В качестве носителя используют си- 2О лохром С-80, модифицированный до хлорангидридного производного (10 "—

10 моль хлорангидридных групп на

1 г носителя). К носителю добавляют холинэстеразу и перемешивают в течение часа в фосфатном буфере при охлаждении..Затем препарат прошывают охлажденным раствором 1 М NaC1 и во дой. Способ позволяет увеличить удель1 ную активность иммобилизованного фер мента с 32,27 до 80%, от удельной ак-! тивности исходного ферментного препа рата.

Пример 1. Активация карбок сильного производного силохрома С-80.

Активацию проводят следующим обра зом. 3 r силохрома С-80, модифицированного до карбоксильного производного, суспендируют в смеси 15 мл абсолютированного хлороформа, 2 мл хлористого тионила и 0,2 мл диметилформамида. Суспензию нагревают до кипения и перемешивают с помощью мешалки

5 ч. Затем смесь фильтруют и промывают 300 мл абсолютного хлороформа на „ фильтре N 100. Осадок на фильтре освобождают от остатка хлороформа с помощью кипящей водяной бани и водоструйного насоса 1 ч. Носитель содержит 10 — 10 моль хлорангидридных групп на 1 г, Сухой продукт хлорангидрида силохрома С-80 суспендируют в 10 мл О, 1 М фосфатного буфера (рН 7,2) и смешивают с 10 мл раствора холинэстеразы (3,6 мг в 1 мл О, 1 M фосфатного буфера) (12 мг белка на 1 r носителя). ь

Смесь перемешивают 1 ч при 0-5 С. По.лученный продукт промывают на фильтре И t00 охлажденными до 4 0 200 мл

1 N раствора NaC1 и 200 мл ледяной дистиллированной воды. Осадок суспендируют в 10 мл дистиллированной воды и хранят в виде суспензии. Удельная активность — 4,2 ед/мг (807 от исходной). Связывается с носителем 55,57. белка.

Пример 2. Сухой продукт хлорангидрида силохрома С-80 суспендируют в 10,мл О, 1 М фосфатного буфера (рН 7,2) и смешивают с 10 мл раствора холинэстеразы (1 мг в 1 мл О, 1 М фосфатного буфера) (3„3 мг белка на

1 г носителя). Смесь перемешивают

30 мин при 0-5 С. Далее продукт обрабатывают, как указано в примере 1, Предпочтительным является способ иммобилизации, описанный в примере 1, так как этот способ обеспечивает связывание 21 ед. активности фермента на

Ь

1 г носителя, тогда как второй способ всего 2 ед. на 1 r носителя. Кро" ме того, продукт, полученный первым способом, характеризуется значительно большей устойчивостью, Пример 3. Способ осуществляют по примеру i но добавляют 220 мг белка на 1 г носителя (1140 ед. на

1 г носителя). Активность препарата—

267 ep/г (79 мг белка с удельной активностью 3,5 ед/мг).

Активность иммобилизованных препаратов сохраняется неизменной в течение 80 дней. Потери фермента при иммобилизации составляют 40,2%.

Таким образом, предложенный способ позволяет увеличить удельную активность (с 32,.2 до 80%) и уменьшить потери фермента при иммобилизации с

62,27 до 40,27.

Формула и з о б р е т е н и я

Способ получения иммобилизованной холинэстеразы, включающий ковалентное связывание холинэстеразы с водонерастворимым носителем путем инкубации предварительно активированного носителя с ферментом в фосфатном буфере при охлаждении с последующим отмыванием целевого продукта от неспецифически адсорбированного фермента, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью увеличения активности целевого продукта и выхода фермента при иммобилизации, в качестве носителя испо l 4 09656

Составитель В.Муронец

Редактор И.Сегляник Техред Л.Олийнык . Корректор В.Романенко

Заказ 3446/26 Тираж 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб. ° д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная ° 4 льзуют силохром С-80, активированный до хлорангидрида и содержащий 10 — 1

10 моль хлорангидридных групп на

1 r носителя, а инкубацию проводят при соотношении 12-220 мг белка на

1 r носителя.