Штамм бактерий вrеviвастеriuм flаvuм продуцент l - серина

Штамм бактерий вrеviвастеriuм flаvuм продуцент l - серина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СО1ОЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

SU„„ 141228

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕГЪСТВУ

®®аава

) PAT8559 щ@ щцщ

- ЛИО ЕКа

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPbtTN4 (46) 07. 12.91. Бюл. У 45 (2 1) 4094083/13 (22) 18„07.86 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных -микроорганизмов (72) Э.А. Буриков, Н,И. Ждвновв, В.1 . Ясиновский, Л.Ф. Козыреве, A.Ê. Соколов„ Н.В. Алафаева, А.Ф. Болин, Н.Г. Демина и Я.Ф. Румянцева (53) 663.15(088.8) (56) Патент Англии 9 l226786 кл. С 12 Р 13/06, 197I.

Патент GlllA У 3843441, кл. С l2 Р 13/Об, 1974.. (54) ШТАММ ВАКТЕРИИ ВЕЕ7? ВАСТЕВ10И

FLAVUM-ПРОДУЦЕЧТ L-СЕРИНА (5?) Изобретение относится к микро" биологической промышленности и каса" (51) 5 С Ig 11 I/201 С 12. Р. 13/06//

/!(C 12 N 1/20, С 12 R I:13) ется нового штаммв - продуцентв аминокислоты L-серина, который может быть нспальзоввн квк пищевая добавка,. компонент питательных смесей медицинского нвзнвчения, в такме в фармв1 цев«ической и косметической промыщпен- -«1 ности. Цель изобретения - штамм бактерий - продуцент Ь-серинв, обладающий способностью к более высокому накоплению аминокислоты в культурвльнойшидко. сти. Штамм Srevibaeterium f1avum

ВКПИ В-3559 получен путем селекции с использованием И-метил-0-нитро"Мнитрозогуанндина, в в качестве селективных фвкторов 1,5 мг/ип 8-взавденинв, 15 мг/мл « -метил-серинв и 20 мг/мп д

О"метилсерина. Штамм после 72 ч ферментации способен накапливвть в культурвльной жидкости до 15 г/л Ь-серина. 1 табл. С"

14 12289

Изобретение относится к микробиологической промышлеццости и касается нового штамма — продуцента аминокислоты 1.-cåðèíà, который может быть использован как пищевая добавка, Kowпонецт питательных смесей медицинского наэ11ачення, .а также в фармацевтической и косметической промышленНОС 1нa 10

Цель изобретения — штамм бактерий " продуцент Ь-серица, Облада)ощий способнс)стьк) к более вь1со1 ему накоплению аминокислоты в культуральной жидкости. 15

Штамм получен нз штамма дикого типа BI:evibactef.ium flavffm ATCC 14067 в результате ступенчатой селекции с использованием в качестве мутагенноГО фактора Я-метил-Я-ННТро 1EIIHTpoeo 20 гуанидина (11Г), а в качестве селектцвных факто1)ов анало1 ов пуринов и серица: G-азааденица, d-метил-серцна и О-ме1тилсернна в концентрациях .

1,5 мг/мл, 15 мг/мл и 20 мг/мл соот1 ветственно. ЕЕа четвертом этапе селекции клетки родительскога штамма, обработанные НГ„ высeHIIff Ila минималь" ную среду с повышенным содержанием фосфата (КЕ1 Р0,1), содержащую алании в качестве нсточника у..-лерода, Па. этом этапе вью;с:пен штамм 1560Ц и в

p B JI 5 H e ÛE1e E:. e I Î e c T e c TP P H I E bI I f в а р и а Н т

15604-1". (схе1)а селекции j .

Схема селекции продуцентов L-ceРина 1

ПГ

° 4067 "- — -— 1 — --".,) б

8-азаадеНИН, „г)

Е;

I ò/МЛ

Й метил сe )Нц с10 ! э мг/мл

EE E фь№

)дан);н в 1 аче," в f. Нс- йэ

cерин

20 мг/мл, точ ник а уг лерода, цо-

))ЫШЕ)1НОЕ СОниже .

Оптимальная емпе=ат -)а,оста

28- 30 С .

Растет и )и ;) ;№ в д,1Г)„-::оне 6-8 ч.

Практи))еское нопоп) зо".за)№и ?1 е - лагаемого ш) а, .:.:".-ироду) ента 1, .-cepHIIB

Осуществляют с))сдук)щнм )бва",ом „

Кцд,туру -, 1.-;мма .Ej- f; gvfIK) 3)Я 1

В-355 g выращи))аю.- в течe)HН 24-36 при 28 С на;:.;Гариэованнай «.Реде " от-, TУРе, ПГ

),обЩ . 11351

0-М Е i HJI = держание фос@ата 50

-без мутагена

° " -) 15бОА

15604-15, 1 .1тамм хранят и столбиках полужид-когс (О 77.) агара под с)1оем 1)азелн" о ф ново.",.; масла прц температуре 2-4 С или в лиоф1)льном состоянии в запаянных ампулах прп комнатной темпера111тамм В. EIBvf1)B Б11ИИгснет 1ка

1560ч-.l 5 депоцировап Всесоюзной кол-. лекцией промышленных мик1)оорган1)змов под номером В1(ПИ В"3559 и имеет сле" дующую кульTypa,ff;-Io-морфологическую и >нзиолого-биохимическую характеристику.

Еультуральио-мо))фологцческие признаки °

Морфология клетск. кле1 ::.H овальные размером 1,0-1 И х 0 " --О, 9 мк неподвижные, грамположител-:пп)е, спор не образу)от.

Рост на ИНЛ 1ли агаре Хо 1т)п)гера: через 3-5 су" îê роста при 30 С образуют кОлонии д11аметром 3 5 11м еремо-вые поверхность гладкаяр форма Bhf» пуклая, край ровный„ структура однородная. При посеве штрихом через 3-е суток росТ умеренный > IfpBA гладкий) поверхность матовая, глотная „ 1;вет желто-кремовый. Прц посеве уколом рост в глубине агара слабый, на поверхности умеренный.

Рост ца минеральной сг№еде Гловер с глюк )э ой № 0110THHol I IH тиамнцо)11 Че рез 3-е с„"" ок 11 pf! 30:". Об„..>." э, ются округл:. колон)1 1 диаметром 2:аi

Ki" зй PQB)lbIH . c . 1) JK". w¹Ра 1-1) Hoво) 1.) аЯ ко н с ис т № н ци я т е с тс о а О а ti 11 0. и „ц ),3 е э к .ность г)-адк":ë, .вет oлоций желто " кремогый, Рост штлих"l чеез 2-е суток умеренный, поверхносг. )а№овая, ;хел; о-кремового цвг=та.

Фиэиоло)"o-бнохими" скне признаки.

Ьтношецце к исто:1 Якам углеРоДа: хорошо р:стет на глюкозе, мальтоэе, сах роэе> 1):-мнозе ф1)укгоэ") ман 1нте) (орбит № № Ile рас rе г II,"¹ а .)Я()иноэе, лак тозе, 0 1ношен) е к нс i оч)!якам аэ 1 аa „гСВа)№ВаЕ 1 аз.п:1;))№1."„,1-,1,1" Hf т - r Off r¹)f Н 11О№ ч» кины, Жела);..у H«= .аэ-..":If):faery.

Рос" a,):i,„;

;9РО6 ) „

Растет пр;. Температуре )7 ;№ и

14)2288 г лицин, применяется перскристаллпз.> ция из 20-30%-ного раствс ра этанола, Выход кристаллического серина нч ферментационного раствора составляет

30-65, чистота конечного продукта не менее 99 ..

Пример 1. Культуру штамма

В, flIIvum ВКП)) В 3559 выращивают

24 ч на агаризованной среде Хоттингера, затем петлей высевают в колбы емкостью 250 мл, содержащие 15-30 мл посевной среды. В качестве посевной среды используют бульон Хоттингера, сод"..ðæàùèé 0,5 с.ахарочы.

После засева культуры колбы устанавливают на кругoIIvlo качалку и IIbl рашивают посевной материал при 220240 об/мин в течение 24 ч при 28 С.

Готовый посевной материал в количестве 10 (по объему) вносят в колбы емкостью 250 мп, содержащие 15 мл ферментационной среды следующего состава, г/л: сахароза — 120; (NH4) S0+

2Р0 4 094 Mgs04 ° 71)20 — ot4 ° мел — 35,0; кукурузный экстракт "

4,0; биотин или дестиобиотин

l50 мкг/л; тиамин — )00 мкг/л; водопроводная вода — остальное, Все компоненты среды стерилизуют вместе при

0 5 атм в течение 30 мин. Ферментацию проводят на указанной выше качалке при 28 С. После 96 ч культивирования в культуральной жидкости образуется )4,5 г/л L-серина, а также аланин, глицин и глутаминовая кислота.

Выделение кристаллического L-ce" рина проводят следующим образом:

380 мл культуральной жидкости с концентрацией серина )4,5 г/л, содержащей также 6,3 г/л глутаминовой кисло" ть1, 2,6 г/л аланина и 1 г/л глнцина, после отделения биомассы пропускают через колонку с сульфокатионнтом

КУ-2-8 в Н-форме. Сорбированные аминокислоты после промъгвки катионита водой элюируют 2н раствором аммиака.

Затем элюат пропускают через колонку с анионитом ЭДЭ-)0H в ацетатной форме для отделения глутаминовой кислоты. Раствор, пропущенный через анионит, выпаривают под вакуумом. К упа- ренному раствору добавляют при перемешивании 1 объем этанола. Выпавшие кристаллы отделяют фильтрованием и промывают спиртом. Затем проводят перекристаллизацию из раствора полученных кристаллов в 24%-ном растворе этанола. В результате получают 3,6 г тиигера, чатем высеивают в предва)..нтельно простерилнзованные вместе с посевной средой колбы для выращивания посевного материала. После засева куЛьтуры колбы устчнавлнвают на круговую качалку H культивируют прн 220240 об/мин при 28-30 С.

Готовый посевной материал вносят

s колбы с ферментационной средой, со-10

«держащей г)сточннки углерода (сахар иЛЯ сахарозу), азота, ростовых факторов, минеральные соли и витамины (биотин, дестиобиотин, тиамин).

Все комгоненты среды стерилизуют )5 под давлением, рН среды доводят до заданного уровня до и после стерилизации.

Фермеитацию проводят на круговой качалке (220-240 об/мин) при 28-32 С. 20

Содержание L-серина в культуральной жидкости определяют методом тонкослойной хроматографии на пластинах

"Silufol" в системе растворителей: ацетон, изопропанол, 25 аммиак, вода 25 (5:5:1,2:0,8) и методом бумажной хроматографии в системе . бутанол, уксусная кислота, вода (4: 1: 1) .

После отделения биомассы нативный раствор пропускают через сульфокати- 30 онит, на котором наряду с серином сорбируются и сопутствующие аминокислоты, которые при последующем элюировании аммиачным раствором также переходят в элюат.

С целью отделения конечного про;

I дукта от глутамнновой кислоты фракции элюата, содержащие серии и со" путствующие аминокислоты, пропускают через колонку с анионитом ЭДЭ-1ОП,)О в ацетатной форме (предварительно обработанный уксусной кислотой). !

Достигаемъ и при этом положитель-, ный эффект обусловлен селективной 4» сорбцией глутаминовой кислоты на анионите ЭДЭ-)ОП в ацетатной форме.

Известные в практике ионные формы аннонита, применяемъ е для разделения нейтральных и кислых аминокислот, не

50 позволяют решить поставленную задачу отделения серина от глутаминовой кис" лоты, так как анионит в ОН-форме сорбирует все находящиеся в растворе аминокислоты, а анионит в С1-форме или с анионами других минеральных кнс

55 лот их вообще не сорбирует.

Для отделения серика от нейтральных аминокислот, таких как алании, 1/}12288 кристялли !еского вещества с содержя.)ием серипя ие менее 99,07..

}1 1} и м p p 2 ПОсе!111(}i! м<этер)lял

КУЛЬТУРЫ г)т<11Я)д В ° f 1Я)211гс} ныРЯП)ина!0т р кяк н г:римере 1, но ВКПМ 8-3559 ия носе н1!О!1 (.1}еД(. слеДУю)1!PГG сосTQII3 р г/л. Са)(яроэа - 20,0; (1111@)280,) — 7,0; яр<<куру з ив)! t э к с <р<) кт " 30 р 0; 11ЯБО! х

71)0< - 1 0 р M„".л — 5 < 0 р д<»с" тг(оиотгп)

50 мкг!.1;, .водопроводная водя — o(. тял)р foe. ;11;рег:„1 до -с } ерилиэации довод<эт раствором КЯ011 до 8Ä0»8,2.

1<се кб)!1!о !еиты среды стериализуют в)1е сто и";1 0 р 8 ятм ":: т(чеино 30 м<1И, ГО то} Eifi. посев! !(<Й мяте риал 1}нос ят н

1(оли)еr ".Ве ОЯ (no объему) в кол(}ы емкость(0 750 2в), содepò .nI!Efe 20 мл ферс!ептяц!)оиной среды cn(12

1<П„РΠ— 0,5; К;SO ° 7П О вЂ” 0,5; кунуруэиы,"! экстракт — 5,0:. Мел — /),0; ,}I e <-. T f1Î би О т «; — i 0)3 M Ic F /л; T 21 R M i! <1 ! 00 )???? ?? >

)се ком))оп(",11»1 среды стерили=}уют

Вместя ч} "1 Й 5 ятм Б течение . 30 ми«." р? OMeи ),.f}0 flggoyf pl "i< 11;l кячят}кe и) .}

;!О,, - п п»)Mope 1,. После 72 ч в .;уль (ура!1»1)ой ж))дкости накапливается

0 < . П <»Pii

11<<1 ц(л < ilr (. }c } i:.с..

1)<) проводят «кяк и н пр}(мере 1, из ,18 < мг» кульT !}p

Э ( це))т1}яцие:l сериия 15,0 г/л, содержаеЦе)! "Якжн ) 2 },< и 1 путам)!11011<э!1 кислоты р

Г /Л <)n<) 11И))Я 11 l Г /Л ГЛИЦИИЯ ° 3 РЕзульт ". т< пОлучяют 2, 8 : к1}ис тяллического нен)(.стн:.." содержанием сер!(иа не м(-..п ° р с}() Оi., П р ри и е р З..гсультуру проду" цэптя В. }< 1 я.}))))) Б10111 8-3559 11ь)ря)ци1<<< Р О «КЯ«!ЯC Il l }})} fe P(3 ЯTO21 с<сo гlе,!3 (IN к !IP Ок р с! ".)етых (.

-г -р!» ) Вносит н 1(0nоь) PMico„T»10 1зОил с 60 1(л ж):д -o:I спец! i (лецую)дего сое» Tæ;"-... r /!i: ся<«яр 30: к, куруэпE.((:; -.Стр-(!IC T ?0; (}fi-i .)), 80, 7.; К1121}0

5,0 "10" "; (ll )Ml}<. 50 ° 10 ; мел 5; вода О(.тяльион.

".Ос ениую с. ряду г)(ред добявлеfl}le)1

1- ела оде)оляр)ивярят <1Я0<1 до )зП / р6-7,8 °

Пое. <нп(з"! )ит риал выра)с)инают иа .. 3 -. 55 кругo, i кя<)алке ирп 28- О 0 н тече" .

11< Ie 25 -30 -1 . I ОТО <}bl<1, ..} «.н И-.. <(Материал:н ко.с)ич ес. тг) е 8-107. (tlo о }ъе) гу) н"!«}(.. IT н (1>(»чмеит 3!1})o)o!4 сред/ следую!него сост))ня, г/л: сахар 100; кукурузный зк-.тракт 5 (NH ) S0}f 131

"р 2

КН РО 0,5; И@80 0,5; тиямии 1,5 10 дестиобиотин 3,0 ° 10 ; пеиога<.итель мел ЗО; вода остальное. рП среды перед добавлением мела доводят ИЯОН до 7,6-7,8. Фер!!ентя)2ию проводят н фермеитере с рабочим объемом 0,5 л. Реж!22! фермента(!ии: яэрирот)ание культура!!!ной жидкости 0,5Л/мии при постоянном пере Ie! IIF1янии 800 об/мин и температуре 30" 32 С .р.П с тятироня» иие Б первые /}0 ч куг1ьтив}!р(}вяния ия уровне 6,5-7 рО осу))1ествпя 0т IiyTefa подач и B куль туряльиу10 жидкость под питки н ниде смес;! саха>я и аммиачной води при концентрации саара ь смеси 420 г, л и мяceовог! соот!1о)2)енин сахар. азот — 14: l „ Hp» зтoM потребляется 60-70 1(г! подпитки. HOOIIe 40 ч

Фериеитаци}1 подл !Tlcv отключают и далее pll с татирОБЯ I!!.e рlй уров)1(. } р 0

6,5 Оеущестнл})ют эа счет име)0)с)егося в с <)еде гле.гга «(«« е рме итя 1 .И}0 э яка)(чин я !

От через 73 ч после эясеня аппарата, когда когцентряция сакяря н культу" галь)}ой жи,"кости с})ижя()т..я до нуля.

Ксз)1-,, е:1Tp<)uEls: L-с с . }}и на н ку. ьтуряль н(}ь жидl(ос l !},).((Стигяет } 4,5 Г/л.

В!)делен; е 1.,-сер}}иа проводят иэ

380 мл ку.)1)ртуг}.;}з)ьг)ой;<:иг))(ости с конце!)тряци()й сер)рп-.- I/},5 г/л, содержадей также 10,5 г/-) глут()миновой ки"ло) 11 р 8 г/л Я::„-:1)и!)Я и 1 г/л глицина.

Выделение сер,rfa p(l с гадин перекристаллизац

1,7 г кристялг,он с содержанием } -сер!11(а Ele менее 9}9t..

Пример А. ПосевнОЙ мят риал готонят, кяк в примере .1, . . вносят

1 н Фермента)<ионну)0 среду сле)рующего сос таня, г/л: сахар 60; кукуруз ный экстракт 5;, ЫН ) S0< 10; К(1 РО

О}5; И8ЯО, 7Н,О 0,5; тиямин 1,5.10 дсстиобиотии 2,0 10 ; пеногаситель

Н<ОДЯ ОС Т-" ЛЬ)(ОЕ, р11 среДЫ ДОВОДят с пОМОЩью г«ЯОН до 7,6-7,8. (1}ермег!тац)(1}} пронодят в ()}ерментере с раб}очи!! Объемом 0,5 л при следуюн(е2! режиме: язрироняние культураль" пой жидкости — 0,5 л/мин при постоянном переме(2)ивянии 900 OG/Mèí и температуре 30-32 О. р21-статировяние в пер! ные 40 ч культивирования на уровне

1412288

8-аэаадеиина в ростовой среде, мг/мл

Штамм

В. fiavem

2 г

Оптеп1еская пло алость

On".1ò÷åñêaë % плотность

0,67

0,20 30 дp445

ЛтСС 14067

ВКПИ 3-3559

1 0,41 !03

Составитель Л ° Минеева

Техред H.Õîä:.íè÷ КОЕрре11:.Ор B. Г-Ерняк

Редактор Н. Козлова

Тираж Подписное

ВН1".ИПН Государственного комитета СССР по делам изобретений и oòêðblòèé

1i3035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 4664

Производственно"полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул ° Проекгная, 6,8-7„0 осуецествляют путем подачи подпитки в культуральную жидкость в виде смеси сахара и аммиачной воды при концентрации сахара в смеси

455 г/л и массовом соотношении сахар:

;азот - 28:i. При этом потребляется !

40-150 мл подпитки. Далее производят смену сахароаммиачной подпитки на

20Х-ньей раствор _#_aGH, который подают автоматически в аппарат при том же уровне рН-статировапия до конца ферментации (35-40 мл).

Ферментацию заканчивают череэ

1 .72 ч после засева аппарата, когда кон. центрация сахара в культуральной жнд"" кости снижается до нуля. Накопление е .:-серила в купьтуральной жидкости— 0 2 г/Выделее1ие 7."серина проводят из

300 мл культуральиой жипкости с концентрацией серина 10,2 г/л, содержаще11 также 10 г/и гнут,".::и;оврй кислоты и 6 г/л аленина. Вчделен11е сари.:."а до стадии перекрнсталлизацие 1 р 1водят как описано в примере 1, зрекрисгай- лиэацию провод,1 е пэ 2Ол ного водного раствора этае1ола, В результат= получают 1,2 ", кристаллов с со.1еuжaпиеее

L Сере1на «re мее1ее

Получен11ые р1эy:;ь.; ат1 свидетельствуют о гом, ч Ет с помоцью итамма

В, Г1 аъл11д Bfi1111 Ч 355о мр;%;но 11олучач ь боле-" высокие уровни солар.-:,аиия 1,-се р11не. "l куГ ьтура:1ьно1.; жицкости а также ;:ре.1а;. аЕы эеой ",ннскислоть1 в» I с о к Он с т е и с. ни ч ис т о l ь

Ф G p и у л а 1=; з. о б р е т е н и н

Штамм бактерий Втел; Ьас1;его.1я11 Г1а-:Um ВКН! 9:-3659 "- пподне". ь-сеои la.