Штамм бактерий neisseria meningitidis серовара в, используемый для получения менингококкового адгезина

Штамм бактерий neisseria meningitidis серовара в, используемый для получения менингококкового адгезина

Реферат

 

Изобретение относится к медицинской биотехнологии и касается получения менингококкового адгезина, используемого для определения степени адгезии менингококков. Цель изобретения - изыскание нового штамма серовара В, пригодного для получения менингококкового адгезина. Штамм Nеisseria meningitidis B-202 выделен из носоглотки бактерионосителя и депонирован под номером ГИСК N 159. Штамм растет в питательной среде, содержащей сыворотку крови и глюкозу, обладает стабильными адгезивными свойствами и обнаруживает значительное количество фимбрий. Минимальная гемагглютинирующая концентрация при тестировании на эритроцитах человека (0,8-6)10⁷кл/мл. При взаимодействии со щечными эпителиальными клетками человека индекс адгезии составляет 30-80. Полученную биомассу лиофилизируют в сахарозожелатиновой защитной среде с последующей стерилизацией гамма-облучением.

Изобретение относится к медицинской биотехнологии и касается получения менингококкового адгезина препарата бактериального происхождения, используемого, например, для определения степени адгезии менингококков при их взаимодействии с клетками макроорганизма. Цель изобретения изыскание нового штамма серовара В, пригодного для получения менингококкового адгезина. Штамм выделен из носоглотки бактерионосителя. Штамм В-202 депонирован над номером ГИСК N 159 и характеризуется -следующими признаками. Культурально-морфологические признаки штамма. Полиморфные грамотрицательные диплококки размером 0,8-5 мкм, неподвижны. При электронной микроскопии обнаруживается значительное количество фимбрий. Хорошо растет на плотных и жидких питательных средах при добавлении к питательной основе сыворотки крови и глюкозы или мальтозы. Через 1 сут. культивирования на плотной питательной среде образуются мелкие прозрачные колонии диаметром 1 мм. Физиолого-биохимические признаки. Оптимальная температура культивирования 37^oС, оптимальный рН 7,2-7,6. Биохимическая активность выражена слабо. Из углеводов ферментирует с образованием кислоты без газа глюкозу и мальтозу. Не ферментирует сахарозу, маннит, лактозу, рафинозу, сорбит и дульцит. Антигенные свойства: относится к серологической группе В. Патогенные свойства: является строгим антропонозом. При внутрибрюшинном введении белым беспородным мышам 0,8-1,0 млрд.микробных клеток. в течение 2 сут. наступает гибель. Адгезивные свойства: при взаимодействии in vitro со щечными эпителиальными клетками человека индекс адгезии составляет 30-80. Минимальная гемагглютинирующая концентрация при тестировании на эритроцитах человека 0,8-610⁷ кл/мл в зависимости от индивидуальной принадлежности эритроцитов. Использование штамма иллюстрируется следующими примерами. П р и м е р 1 Получение менингококкового адгезина. Лиофилизированный штамм N. me- ningitidis В-202 высевают на чашки Петри с 2%-ным агаром Хоттингера, в который добавлено 20% инактивированной лошадиной сыворотки и 0,5% глюкозы. Чашки инкубируют в течение 20 ч при 37^oС. Выращенную культуру контролируют на чистоту микроскопированием чашек с посевом при косом освещении. Чистые культуры смывают водным раствором, содержащим 10% сахарозы и 1,5% желатины, контролируют мутность смывов по стандарту мутности ГНИИСКа им. Л.А.Тарасевича. Далее тем же раствором доводят мутность до 10 млрд. микробных клеток в 1 мл, после чего контролируют гемагглютинирующую активность, которая в данном примере составляет 8 х 10⁶ кл/мл. Микробную взвесь разливают в ампулы по 1 мл, замораживают в эталоне при минус 70^oС и лиофилизируют. Гемагглютинирующая активность высушенного штамма 1,610⁷. Ампулы с высушенным штаммом запаивают, а затем подвергают гаммаоблучению в дозе 1 мрадПолученный целевой продукт (менингококковый адгезин) контролируют на стерильность и гемагглютинирующую активность с эритроцитами человека, которая в данном примере составляет 1,610⁷. Гемагглютинирующая активность по результатам нескольких опытов находится в пределах (0,8-6)х10⁷. П р и м е р 2. Определение степени индивидуальной чувствительности щечных эпителиальных клеток (ЩЭК) людей к адгезии менингококков. Определение адгезивной активности осуществляют по способности менингококков in vitro необратимо прикрепляться к щечным эпителиальным клеткам (ЩЭК) человека и агглютинировать эритроциты человека. Полученные путем соскоба ЩЭК трехкратно отмывают в 0,158 М фосфатном буферном растворе, рН 7,2-7,3, от посторонней микрофлоры, смешивают с регидратированным препаратом менингококкового адгезина, полученного согласно примеру 1, из расчета 2000 микробных клеток на одну ЩЭК. Смесь инкубируют в течение 1 ч при 37^oС при постоянном перемешивании, затем трехкратно отмывают указанным буфером. Осадок отделяют на лабораторной центрифуге при 1000 об/мин в течение 10 мин. Из него готовят мазок, который окрашивают по Граму. Подсчет прикрепившихся менингококков к ЩЭК производят под микроскопом по среднему значению просмотра не менее 25-ти ЩЭК. Среднее количество менингококков, прикрепившихся к одной ЩЭК, принимают за индекс адгезии. В данном примере всего обследовано 12 человек. Индекс адгезии у обследованных оказался в интервале 25-53. П р и м е р 3. Определение степени индивидуальной чувствительности эритроцитов людей к адгезии менингококков. Препарат адгезина разводят с шагом 2 указанным буферным раствором. В каждую лунку планшета с данными разведениями вносят З%-ную взвесь отмытых эритроцитов обследуемых людей. Реакционные смеси инкубируют в течение 1 ч при 37^oС, а затем помещают на 18 ч в холодильник при 2^oС. Далее определяют минимальную гемагглютинирующую концентрацию менингококков (МГАКМ/мл), вызывающую отчетливо выраженную агглютинацию эритроцитов. В данном примере обследовано 82 человека. Значения МГАКМ/мл для эритроцитов обследованных оказались в пределах 3x10⁷ 5x10⁸. Эти данные показывают, что индивидуальная чувствительность эритроцитов обследованных к адгезии менингококков различалась в 16 раз. Изобретение обеспечивает безопасность использования препарата за счет его стерилизации гамма-облучением, получение менингококкового адгезина из штамма серо-группы В, возможность обследования индивидуальной чувствительности как на ЩЭК, так и на эритроцитах, стабильность адгезивной активности препарата при его хранении, повышение точности обследования.

Формула изобретения

Штамм бактерий Neisseria meningitidis серовара В, ГИСК N 159, используемый для получения менингококкового адгезина.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Номер и год публикации бюллетеня: 36-2000

Извещение опубликовано: 27.12.2000