N-нитрозо-n-(бэта-хлорэтил)-карбамоилпептиды или их хлоргидраты,обладающие противоопухолевой активностью

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение касается замещенных пептидов, в частности М-нитрозо-Н-(Й- -хлорэтил)карбамоилпептидов общей формулы rClCHjCH2-N(NO)-C(0)NH}nR, где п 1 и R-Lys-Prc-Val-NH , Trp-Leu-u( -Asp-Phe-NHj , Pro-Val-NH , Gly-Lys-Pro-Val-NHj, Trp-Gly-Lys-Pro- -Val-NH ; n 2, R Lys-Pro-Val-NHj, или их хлоргидратов, обладающих противоопухолевой активностью, что может быть использовано в медицине. Цель - создание новых более активных пептидов . Их синтез ведут обработкой соответствующего ацетата В-хлорзтилизоцианатом в присутствии триэтиламина в среде диметилформамида. Новые вещества обладают лучшей активностью в отношении лейкомии L 1210, амеланотических меланом, легочных опухолей, чем известные цитостатические агенты - хлорозотицин или BCNY. 9 табл. « сл

СОЮЗ С08ЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

llO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3605466/23-04 (62) 3506053/23-04 (22) 20,06.83 (23) 15.11.82 (31) 3073/81 (32) 22.10,81 (33) HU (46) 07.08.88. Бюл, N 29 (71) Хиноин Дьедьсер еш Ведьесети

Термекек Дьяра PT (HU) (72) Хелга Шюли, Кальман Медзихрадски, Хедвиг Медзихрадски, Карой Лапиш, Ласло Коппер и Андраш Йенеи (HU) (53) 547 ° 964.4.07(088. 8) (56) Jonston Т.P. и др. J. Med.chem, 1963, 6, 669. (54) N-НИТРОЗО-N- (БЭТА-ХЛОРЭТИЛ) КАРБАМОИЛПЕПТИДЫ ИЛИ ИХ ХЛОРГИДРАТЫ, ОБЛАДАКМЦИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ (57) Изобретение касается замещенных

„„Я0„„1414851 д 1 (51)4С 07 К5 10 А61 К37 02 пептидов, в частности N-нитрозо-N-(8-хлор этил) карбамоилпептидов о бщей формулы jClCH СН -N(NO) C(0)NH „R, где n = 1 и R — 1,уз-Pro-Val-NH

2>

Trp-Leu-ol-Asp-Phe-МН2, Pro-Val-ИН

Gly-Lys-Pro-Val-NH,, Trp-Gly-Lys-РгоЧа1 БНт n = 2 R Lys Pro Val ИН или их хлоргидратов, обладающих противоопухолевой активностью, что может быть использовано в медицине. Цель— создание новых более активных пептидов. Их синтез ведут обработкой соответствующего ацетата Й-хлорэтилизоцианатом в присутствии триэтиламина в среде диметилформамида, Новые вещества обладают лучшей активностью в отношении лейкомии L 1210, амеланотических меланом, легочных опухолей, чем известные цитостатические агенты — хлорозотицин или BCNY. 9 табл.

1414851

Изобретение относится к новым биологически активным соединениям N-нитрозо-N-(бэта-хлорэтил) карбамоилпептидам или их хлоргидратам, обладающим противоопухолевой активностью, кото5 рые могут найти применение в медицине.

Цель изобретения — поиск новых производных пептидной структуры,об-. ладающих более высокой противоопухолевой активностью, Пример 1. Альфа, эпсилон: -бис-(бэта-хлорэтилкарбамоил)лизил пролилвалинамид. 15

736 r (1, б ммоль) лизилпролилвалинамиддиацетата растворяют в 8 мл .диметилформамида и раствор охлаждают о до О С. Далее в раствор по каплям : добавляют 0,46 мл (3,2 ммоль) триэтил-20, :амина и 0 34 мл (4 ммоль) бета-хлор, :этилизоцианата. Реакционную смесь ,перемешивают при О С в течение 4 ч, после чего ему дают постоять и перегоняют в вакууме, Остаток смешива- 25 ют с водой, выпавший в осадбк продукт отделяют фильтрованием и сушат, Таким образом получают 480 мг указанного соединения. Выход 54%; т. пл.

183-1850С; R f = 0,75 (смесь н-бута- ЗО иола с пиридином, ледяной уксусной кислотой и водой в соотношении 4;I!1:

:1; тонкослойная хроматографическая обработка с использованием Кизельгеля G).

Вычислено, %! С 47„82; Н 7,11;

N 17,74; Cl 12,83, С Н уИ О С1 (552в5).

Найдено, %; С 47,90; H 7,60;

N 17,41; Cl 13,26.

R g = 0,82 (этилацетат, пиридин„ ледяная уксусная кислота и вода в соотношении 60:20:б:11); В.г = 0,72 (бутанол, ледяная уксусная кислота и вода в соотношении 4 .1:1) .

Пример 2. Альфа, эпсилон-бис-(И-нитрозо-М-(бета-хлорэтил).-, карбамоил)лизилпролилвалинамид, 460 мг (1 ммоль) лизилпролилвалинамиддиацетата растворяют в б мп диметилформамида, после чего в приго- 0 товленный раствор добавляют 0,28 мл (2 ммоль) триэтиламина,и 548 мг. (2 ммоль) И-нитрозо-бета-хпорэтилкарбамоил-и нитрофенола, а затем

270 мг (2 ммоль) 1-оксибензотриазола. По истечении 2 ч диметилформамид отгоняют в вакууме, остаток растворяют в 30 мп этилацетата и экстрагируют водой.. Этилацетатную фазу сушат, упаривают. Остаток обрабатывают безводным диэтиловым эфиром, затем диэтиловый эфир декантируют и масло высушивают. Полученную таким образом твердую пену чистят в колонке, заполненной силикагелем. Фракции собирают и растворитель отгоняют в вакууме.

Остаток растирают в порошок в присутствии безводного петролейного эфира и отфильтровывают. Таким образом получают 312 мг указанного соединения, Выход 517.

Rg указанного соединения 0,80 (смесь метанола с этилацетатом в соотношении 1:3; тонкослойная хроматографическая обработка с использованием Кизельгеля С), R = 0,79 (бутанол, ледяная уксусная кислота и вода в соотношении 4:1:1).

Rg исходного продукта 0,88 (смесь этилацетата с пиридином, ледяной уксусной кислотой и водой в соотношении

240;20:6:11; тонкослойная хроматографическая обработка с использованием

Кизельгеля G).

f = 185 (iV-нитрозогруппа, 397 нм).

Вычислено, %1 Cl 11,59; И 20,61;

С 43,17; Н 6,05.

С,, Н И О уС1 (611,51) .

Найдено, %: С1 11, 18; N 20. 07;

С 43,21; Н 6,02.

Пример 3. Альфа, эпсилон-.

-бис-(И-нитрозо-N (бета-хлорэтил).карбамоил )-лизилпролилвалинаиид.

К 552 мг (1 ммоль) альфа, эпсилон-бис-(бета-хлорэтилкарбамоил)лизилпролилвалинамида добавляют 10 мл

997-ной муравьиной кислоты, после чего в течение 1 ч в эту смесь добавляют по каплям раствор 500 мг нитрита натрия и 3 мл воды. На следующий день реакционную смесь выпаривают в вакууме. Остаток обрабатывают водой, фильтруют и промывают водой.

Таким образом получают 460 мг указанного соединения. Выход 75%.!

Rg = 0„80 (смесь метанола с этилацетатом в соотношении 1:3, тонкослойная хроматографическая обработка с использованием Кизельгеля G).

Е = 184 (N-нитрозогруппа, 397 нм).

Вычислено, %: Cl 11,59; И 20,61;

С 43,17; Н 6,05.

С Н „И О С1 (611,51) .

Найдено, 7; Cl 11,41; N 20 10;

С 43,16; Н 6,04.

1414851

Пример4. а) Альфа-N-нитрозо-И- (бета-хлорэтил) -эпсил он-трет-бутилоксик арб ониллизилпролилв алин амид.

614 мг (1 ммоль) эпсилон-трет-буток-5 сикарб амоилли зилпр олилв алин амиддозилата растворяют в 10 мл безводного диметилфорамида, после чего в приготовленный раствор добавляют 0,14 мл (1 ммоль) триэтиламина, 274 мг (1 ммоль) N-нитрозо-бета-хпорэтилкарбамоил-и-нитрофенола и 136 мг (1 ммоль) 1-оксибензотриазола и реакцию проводят аналогично изложенному в примере 2. Таким образом получают

250 мг указанного соединения . Выход

43Х.

Нг укаэанного соединения 0,90 (смесь хлороформа с метанолом в соотношении 9:1, тонкослойная хроматографическая обработка с использованием

Кизелвгеля G); Кг 0 92 (этилацетат, пиридин, ледяная уксусная кислота и вода в соотнощении 60:20,6: 11); Нг исходного соединения 0,80 (смесь

И-бутанола с ледяной уксусной кислотой и водой в соотношении 4 1: 1; тонкослойная хроматографическая обработка с использованием Киэельгеля 0).

Е 90 (И-нитрозогруппа, 39? нм).

Вычислено, Ж: С1 6,15; И 17,02.

С 4Н4 И 10 С1 (576, 10) °

Найдено, Х: С1 6 ° 00, И 16,61. б) Альфа-(И-нитроэо-И- (бета-хлорэтил) -карбамоил )-лиэилпролилвалин- Зб амидгидрохпорид.

200 мг альфа-(И-нитрозо-п-(бетахлорэтил)карбамоил)-эпсилон-трет-бутоксикарбоннллизилпролилвалинамнда смешивают с 6 мл 0,17 н,раствора муравьиной кислоты в соляной кислоте и раствору дают постоять в течение 5 мин с последующим его выпариванием. Остаток растворяют в воде и экстрагируют этилацетатом. Водный слой лиофилизируют. Таким образом получают 140 мг указанного соединения.

R = 0,10 (смесь н-бутанола с ледянои уксусной кислотой и водой в со- ВО отношении 4:1:1, продукт Кизельгель

С) s Rg = 0,64 (этилацетат, пиридин,." ледяная уксусная кислота и вода в соотношении 60:40:12:22); Rg = Os1 (метанол и этилацетат в соотношении

ЗФ1).

Вычислено, ; С1 13,84; N 19, 13;

С 44,49; Н 6,83.

С 14Hg.>NqOgC1 i (512,44) .

Найдено, : Cl 13,72; N 18,81;.

С 44,51; Н 6,80.

E = 88 (N-нитрозогруппа, 397 нм) .

П р и и е р 5. Бета-хлорэтилкарбамаилтриптофилнорлейцил-альфа-аспарагилфенилаланинамид.

615 мг (1 ммоль) триптофилнорлейцил-альфа-аспарагнлфенилаланинамидгидрохлорида растворяют в 6 мл безводного диметилформамида, после чего в приготовленный раствор добавляют О, 14 мл (11 ммоль) триэтиламина и 0,1 мл (1,2 ммоль} бета-хлорэтилнзоцинатан дальнейшую часть реакции проводят аналогично изложенному в примере 1. Таким образом получают

600 мг указанного соединения. Выход

88Х. Т.пл. 201-202 С.

Вычислено, Х: Cl 5 ° 18; N 14,33;

С 57,883 Н 6,14 °

СЗ Н4 И7О С1 (684 ° 19) в

Найдено, Х: Cl 4,94; N 13,7 8;

С 57,86; Н 6,12.

R = 0„70 (бутанол, пиридин, ледяная уксусная кислота и вода в соотношении 4 з 1: fò :Ì ) р R g - 0,69 (этилацетат, пиридин, ледяная уксусная кислота и вода в соотношении 60:20:6:11).

П р и и е р 6. И-йитрозо-И-(бета хлорэтил) карбаиоилтриптофилнорлей» цил-альфа-ас пар агилфеимпаланинаиид.

684 иг (1 ммоль} бета-хпорэтилкарбамоил-триптофилиорлейцил-альфааспарагилфенилаланинамида используют для реакции с раствором 300 мг нитрита натрия и 2 мл сложного э4ира аналогично изложенному в примере 3. Такйм образом получают 605 .аг укаэанно го соединения Выход 35Х.

Rg 0,80 (смесь н-бутанола с,ледяной уксусной кислотой и водой в соотношении 4:1:1, Кизельгель С); R j

0,42 (этилацетат, пиридин, ледяная уксусная кислота и вода в соотношении -120:20:6:11) р Кг 0,72 (бутанол, пиридин, ледяная уксусная кислота и вода в соотношении 4:1:1:1).

Вычислено, : Cl 4 97; N 15 71;

NO 4,20; С 55,52; Н 5,75 °

С УН +

Найдено, : С 4,73; И 15,28;

NO 3,87; С 55,50; Н 5,77.

Поскольку в диапазоне нитрозогруппы имеет место поглощение самого пептпда, в данном примере нитрозную группу определяют по методу Лоо и

Диона.

1414851

5

Пример 7. N-Нитрозо-N-(бета-хлорэтил) карбамоилтриптофилнорлейцил-аль фа-ас п ар агилфе нил алан ин амид.

Аналогично изложенному в примере

1 проводят реакцию 92 1 r (1,5 ммоль) триптофилнорлейцил-альфа-аспарагилфенилаланинамидгидрохлорида 0,21 мл (1,5 ммоль) триэтиламина, 420 мг (1,5 ммоль) N-нитрозо-бета-(хлорэтил-. )О карбамоил)-и-нитрофенола и 200 мг (1«5 ммоль) 1-оксибензотриазола, Таким образом получают 800 мг указанного соединения. Выход 75 ..

R g = О, 80 (смесь н -бутанола, ледя- )В ной уксусной кислоты и воды в соотношении 4:1:1, Кизельгель G).

Вычислено, : С1 4,58; N 15 32;

NO 3,92; С 55,52; Н 5,75.

С »,Н,И gOg С1 (713,20) .

Найдено, .; Cl 4,58; N )5 32;

NO 3,92; С 55,51; Н 5,73.

Нитрозную группу определяют по методу, указанному в примере 6, Пример 8. N-Нитрозо-N-(бэта- 2я

-хлорэтил)карбамоилтриптофиллейцил-альфа-аспарагилфенилаланинамид (III). а) 633 мг (1 ммоль) триптофиллейцил-альфа-аспарагил-бета-трет-бутилэфир)фенилаланинамида дают постоять в 6 мл 2 н.раствора этилацетата в соляной кислоте, после чего добавляют в смесь диэтилового эфира, выпавшие в осадок кристаллы отфильтровывают и промывают диэтиловым эфиром. В результате получают 590 мг (выход

93 ) указанного продукта, R = 0,70 (бутанол, пиридин, ледяная уксусная кислота. и вода в соотношении 4:1:1:1); Rg = 0,74 (смесь бутанола с пиридином, ледяной уксусной кислотой и водой в соотношении

30:20:6:24; Кизельгель G); R< = 0,66 (бутанол, ледяная уксусная кйслота и вода в соотношении 4:1;1)3 R л =.

0,10 (этилацетат, пиридин, ледяная уксусная кислота и вода в соотношении 120:20:6:11).

b) 92 ) мг (1,5 ммоль) триптофиллейцил.-альфа-аспарагилфенилаланинамидгидрохлорида растворяют в 10 мл абсолютированного диметилформамида, затем добавляют 373 мг (1,5 ммоль)

N-нитрозо-бета-хлорэтилкарбамоил-¹ оксисукцинимида и 0,42 мл (3 ммоль) триэтиламина, После перемешивания в течение 15 мин диметилформамид отгоняют в вакууме, Остаток растирают в воде, отфильтровывают и промывают водой. В результате получают 980 мг (выход 92 ) укаэанного продукта.

R = 0,69 (смесь этилацетата с пиридином, ледяной уксусной кислотой и водой в соотношении 30;20:6:11, Кизельгель G) Rg = 0,42 (этилацетат, пиридин, ледяная уксусная кислота и вода в соотношении 120;20:6:11);

Rg = 0,72 (бутанол, пиридил, ледяная уксусная кислота и вода в соотношении 4;1;1:1).

Вычислено, : Cl 4,97; N 15,71;

NO 4,20; С 55,52; Н 5,75»

С 1 Н " N 808 Cl (713,20) .

Найдено, .: С 4«58» N 15,32;

NO 3,95; С 55,49; Н 5,78.

Пример 9. а) Альфа-N-нитроэо-И- (бета, хлорэтил) карбамоил-эпсилон-трет-бутилоксикарбонилглициллизилпролилвалинамид, 1,30 мг (2,6 ммоль) эпсилон-третбутилоксикарбонилглициллизилпролилвалинамида растворяют в 13 мл абсолютированного диметилформамида, а затем в приготовленный раствор добавляют 650 мг (2,6 ммоль) N-нитрозо-бета-хлорэтилкарбамоил-N-оксисукцинимида и 0,36 мл (2,6 ммоль) триэтиламина. После перемешивания в течение

15 мин реакционную смесь выпаривают в вакууме. Остаток растворяют в этилацетате и экстрагируют водой. Этилацетатную фазу сушат и выпаривают. В результате получают 1,29 мг (Выход

80 ) ук аз анн or о пр одук та.

R = 0,87 (этилацетат, пиридин« ледяная уксусная кислота и вода в соотношении 60:20:6:11); Rg = 0,82 (смесь хлороформа с метанолом в соотношении 8:2; Киэельгель G); Н г= 0 50 (этилацетат, пиридин, уксусная кислота и .вода в соотношении 120:20:6:

:11) .

Вычислено, .: Cl 5,60; N 17,69, С 1 Н N OgCI (633,16).

Найдено, : Cl 5,48; N 17,31.

Е = 91 (N-нитрозная группа, 397 нм) .

Ь) Альфа-N-нитро э o-N- (бета, хлорэтил) к арб амоил глициллиз ил пр олилв алинамидгидрохлорид (ТЧ).

633 мг (1 ммоль) альфа-N-нитрозо-N-(бета-хлорэтил)карбамоил-эпсилон-трет-бутилоксикарбонилглициллизилпролилвалинамида выдерживают в спокойном состоянии в течение 5 мин в

10 мл 0 14 н. раствора муравьиной. кислоты в соляной кислоте, а затем

1414851

45 раствор выпаривают. Остаток растворяют в воде и экстрагируют этилацетатом. Водную фазу лиофилизуют. В результате получают 540 мг (выход 957.)

5 указанного продукта.

R = 0,1 (метанол и этилацетат в соотношении 3:1); R1 = 0,65 (смесь этилацетата. с пириднном, муравьиной кислотой и водой в соотношении 60:20; 10

:6;5,5; Кизельгель G); Rg = 0,66 (этилацетат, пиридин, ледяная уксусная кислота и вода в соотношении 60:

:40:12:22), Вычислено, Е: С1 12,45; N 19,67;

С 42,24; Н 6,67.

С „Н ВИ8О С1 (569,59) .

Найдено, 7: Cl 12,01; N 18,87;

С 42,22; Н 6,69. с. = 84 (N-нитрозная- группа,396 нм) . 2

Пример 10, N-Нитрозо-N-(В-х торэтил) карбамоилпролилвалинамид, 1,37 r (5 ммоль) пролил валинамидацетата суспендируют в 15 мл безводного диметилформамида и добавляют при 25 перемешивании и охлаждении снегом

1,4 мл (10 ммоль) триэтиламина и

1,25 r (5 ммоль) сложного N-нитрозо-N-(Â-хлорэтил) карбаминовая кислота-N -оксисукцинимидного эфира. После перемешивания в течение 15 мин при .

О С реакционную смесь разбавляют ледяной водой и осажденное соединение отфильтровывают и промывают холодной водой на фильтре. Продукт сушат в

35 эксикаторе над Р О .Выход О, 91 r (53K) .

Rg = 0,8 (смесь хлороформа и метанола в соотношении 8:2, Кизельгель G).

Т. пл. 1300 С (разложение) . (а() 49,04 (с = 1, Me0H); (a ) — 54,25 (с = 1, МеОН).

Вычислено, Ж: С 44,85; Н 6,33;

Cl 10,19; N 20,13.

С Н N 0+ Cl (347,8) .

Найдено, 7: С 144,83; Н 6,35;:

Cl 9,86; N 19,76.

Е = 88 (400 нм).

Пример 11. 4 -(N-Нитрозо-И-(В-хлорэтил) карбамоил1-Я-трет-бутилоксикарбонилтриптофилглициллизил50 пр олилв алин амид.

К смешанному раствору Hs 1,2 r (1, 74 ммоль) трет-бутилоксикарбонилтриптофилглициллизилпр олилв алин амида и 10 мл безводного диметилформамида добавляют при О С 0,24 мл 1,74 (ммоль) 55 триэтиламина и 400 мг (1,6 ммоль) N-нитрозî-N-(В-хлорэтйл)карбамоил-N-оксисукцинимида. Через 0,5 ч реакционную смесь выпаривают. Ост ато к растворяют в этилацетате и экстрагируют водой. Органический слой высушивают над безводным сульфатом натрия и выпаривают. Выход 1,2 г (853).

R = 0,25 (смесь хлороформа и метанола в соотношении 9 1).

Вычислено, 7.: N 17 09; Cl 4,33.

С31Н55 N, ОуС1 (819,37) е

Найдено, X: N 16,72; С1 4,01.

Пример 12. 4 -(N-Нитрозо-N-(8-хлорэтил) карбамоил) триптофилглициллизилпролилвалинамидацет.

819 мг (1 ммоль) Ы-(N-нитрозо-N)-8-хлорэтил)-карбамоил-трет-бутилоксикарбонилтриптофилглициллизилпролилвалинамида дают отстояться в течение

5 мин в 10 мл 0,12 н, муравьиной кислоты с хлористоводородной кислотой, затем раствор упаривают в вакууме. Остаток растворяют в воде, экстрагируют этилацетатом. Водную фазу лиофилизируют, затем лиофилизированный продукт очищают хроматографией на колонке, заполненной силикагелем в соотношении 60:20:б:11 смесью из этилацетата, пиридина, ледяной уксусной кислоты и воды. После упаривания элюентной смеси, остаток растворяют в воде и лифолизируют, Таким образом получают 480 мг (637) соли.

R = 0,25 (смесь этилацетата, пиридина, ледяной уксусной кислоты и воды в соотношении 60:20:6:11).

Вычислено, 7: С 52,36; Н 6,54;

N 17,97; С1 4,55.

С34Н 1 Н о09С1 (779,27).

Найдено, Е: С 52,34; Н 6,54, N 17 00 Cl 4,46.

Пример 13. o(-(N-Нитрозо-N-(B-хлорэтил)карбамоил)-5-трет-бутилоксикарбониллизилтриптофиллейциласпарагилфенилаланинамид.

1,4 г (1,73 ммоль) Е-трет-бутилоксикарбониллизилтрипФофиллейциласпарагилфенилаланинамида растворяют в 15 мл безводного диметилформамида при О С, В процессе перемешивания к смеси добавляют 0,24 мл (1,73 ммоль) триэтиламина и 433 мг (1,73 ммоль)

N-нитрозо-N-(8-хлорэтил)карбамоил-N-оксисукцинимида. После перемешивания в течение 1>5 ч реакционную смесь выпаривают в вакууме, остаток растирают в порошок с водой и фильтруют, Сырой продукт растворяют в этаноле, осаждают водой и фильтруют. Таким образом получают 1,8 d продукта. Выход 677..

i0 дукт растирают s порошок со смесью простого эфира и петролейного эфира и фильтруют. Получают 360 мг (58%) продукта, эквивалентного конечному продукту примера 4.

Пример 17. Осуществляют аналогично примеру 4, но вместо N-нитрозо-(В-хлорэтил)-карбамоил-и-нитрофенола используют (N-нитрозо-8-хлорэтилкарбамоил)-N-оксифталевый.имид, таким образом получают 400 мг (64%) конечного продукта, эквивалентного конечному продукту примера 4.

Пример 18. Осуществляют аналогично примеру 4, но вместо N-нитрозо-(8-хлорэтил)карбамоил-и-нитрофенола используют (Н-нитрозо-Й-хлорэтилкарбамоил)пентафторфенол. Получают 510 мг (83%) конечного продукта, эквивалентного конечному продукту примера 4.

Проводят биологические испытания предлагаемых соединений, при этом проводят сравнение с известчыми цитостатическими агентами: 1,3-бис-

-(бета-хлорэтил)-1-нитрозомочевина (BCNY) и 2-(3-(2-хлорэтил)-3-нитро- . зоуреидо )-2-диокси-О-глюкопираноза (хлорозотицин), Фармакологическая активность предлагаемых соединений демонстрируется результатами испытаний с использованием в качестве испытуемых соединений o(,й-бис-(Н-нитрозо-N-(A-хлорэтил)карбамоил лизилпролилвалинамида (соединение I) и a -PN-нитрозо-N.-(В-хлорэтил)карбамоил лизилпролилвалинамид гйдрохлорида (соединение II).

В табл. 1 показано влияние соединений 1 и II на внутрибрюшинно имплантированную мышам Ь 1210-лейкомию, Соединения I u II более активны,чем

ВСМА и хлорозотицин, используемые в качестве сравнительных веществ.

Опухолевый прививочный материал

10 асцитных клеток, внутрибрюшинно.

Животное-хозяин — самки мьппей вида

CDF. Лечение 3 дня. Токсичность— на 5-й день 4/6 остаются в живых.

Критерий *- Т/С 7 125 — значительная противоопухолевая активность.

В табл. 2 приведены фармакологические свойства соединения II (токсическая доза. 133-200 мг/кг внутрибрюшинно; вещество применяют на мышах, зараженных ? 1210), Приведенные данные доказывают,что новые пептидные производные соепине1414851

Rp = 0,83 (смесь бутанола, пиридина, ледяной уксусной кислоты и воды в соотношении 4:1:1:1).

Вычислено, %: N 14 87; Cl 3,76.

С Н,И,О С1 (491,50).

Найдено, %: N 14,74; Сl 4,12.

Пример 14. o(-fN-Нитрозо-Nl- (В-хлор э тил) кар 6 амоилли зилт ри пт офил лейцилас параа гилфен ил ал анин амид.

941 мг (1 ммоль) d-(N-нитрозо-N -(й-хлорэтил) карбамоил3- Е -трет-бутилоксикарбониллизилтриптофиллейциласпарагилфениланинамида растворяют в 10 мл 0,12 н, муравьиной кислоты с

Хлористоводородной кислотой. Раствор выпаривают в вакууме через 10 мин.

Остаток очищают на колонке с силикагалем со смесью метанола, этилацетата воды в соотношении 2,5:1;0,5. Таким 20 образом получают 580 мг (69%) указанКого продукта.

Rg = 0,66 (смесь бутанола, пирндина ледяной уксусной кислоты и воды в соотношении 4:1:1:1), 2г, Вычислено, %: С 55, 62; Н 16, 30;

М 16,64; Cl 4,20.

С Н И О. С1 (841,36) .

Найдено, %: С 55,64; H 6,28;

N 15,65; Сl 3,96.

ЭО

Пример 15. c(-(И-Нитрозо-N«(B-хлорэтил) карбамоил 1- E -òðåò-бутилокси кар 6 ониллизилпр олилв алин амид (ис поль зуя N-нитро зо- (В-хлорэ тил)карбамоил-N-o сисукцинимид) .

К раствору из 614 мг (1 ммоль)

Н-лиз (БОК)-провал-NH„-тозилата и 10,мл безводного диметилформамида добавляМт 0,28 мл (2 ммоль) триэтиламина и

237 r (0,95 ммоль) N-нитрозо-(Я-хлорэтил)карбамоил-N-оксисукцинимида.

После перемешивания в течение 30 мин рас тв ор упарив ают в вакууме . Остаток растворяют в этилацетате и дважцы экстрагируют водой. Этилацетатную фа45 зу сушат над сульфатом натрия и упаривают в вакууме. Получают 526 мг (86%) продукта.

Rg = 0,92 (смесь этилацетата, пиридина, ледяной уксусной кислоты и воды в соотношении 60:20:6:11).

Найдено, %: N 16,63; Сl 6,02, Пример 16. Осуществляют аналогично примеру 4 с той разницей, что вместо N-нитрозо-(й-хлорэтил)карбамо

Ил-II-нитрофенола используют P N-нитрозо-(8-хлорэтил) карбамоил пентахлорфенол и раствор экстрагируют насыщенным NaHCO, вместо воды, Конечный про1414851

В табл. 5 представлено влияние соединения II на выживание мышей, зараженных лейкемией L1210.

Влияние соединения II на твердую опухоль (табл. 6). S+ - опухоль (подкожно). Дозировка 100 мг/кг или 5х х20 мг/кг внутрибрюшинно (лечение начинают на следующий день после трансплантации) оказалась неэффективной.

Легочная меланома Льюиса и меланома Вц -опухоли, дающие на мышах метастазы (i.m.). Внутрибрюшинное применение, начиная со дня, следующего после трансплантации.

Опухолевые ксенографты человека.

НТ18 (амеланотическая меланома), Контроль - среднее значение ТД

100 мг/кг

22,5 дн.

50,0 дн.(Д

1,0) 5х20 мг/кг 56,25

НТ22 (слизистая карценома толстой кишки) .

Контроль 17,0 дн.

100 мг/кг 24,0дн.(0,29)

5х20 мг/кг 21,5 дн. (0,26)

НТ17 (аденоматоэная карценома толстой кишки).

Контроль 16,5 дн.

100 мг/кг 14,75 дн. (0,0)

5х20 мг/кг 5,0 (О 0)

Время лечения; при достижении объема опухоли примерно 8 мм . Метод лечения: внутрибрюшинно, ТД = удвоение объема опухоли.

ТД е-ТД Ко

GD = задержка роста =

ТД„ где Ке — обработанные, КΠ— контроль, Влияние пептидо-нитрозомочевиновых производных на рост экспериментальных твердых опухолей и опухолевых ксенографтов человека. ния I. u II значительно более активны и менее токсичны, чем BCNY и хлорозотицин, используемые в качестве контрольных агентов °

Исследование связи между эффектом и химической структурой соединений, аналогичных соединению II на мышах, зараженных лейкемией L1210, приведено в табл. 3.

Влияние соединения II в комбинации с фармацевтическими агентами на мышей, зараженных лейкомией L1210, приведено в табл. 4.

Изученные соединения: N-нитрозо-N-(B-хлорэтил)-карбамоиллизилпролилвалинамид НС1; N-нитрозо-N-(8-хлор5 этил)карбамоилглициллизилпролилвалинамид НС1.

Объекты: экспериментальная твердая опухоль: мышиная опухоль S 180, легочная опухоль Льюиса и мышиная меланома В (, опухолевые ксенографты человека: амеланотическая меланома

НТ18, колоректальная аденокарцинома

НТ17, колоректальная аденокарцинома

НТ22 (слизистая), панкреатическая карцинома НТ27.

Эксперименты на экспериментальных твердых опухолях S !80, Опухоль разрезают на мелкие кусочки и эти кусочки подкожно трансплантируют под шкурку спины мышей разновидности СЕРР, Лечение начинают со дня следующего после дня трансплантации, Размер опухолей измеряют кронциркулем, а объем рассчитывали по их диа25 метру. Соединение II (внутрибрюшинно) применяемое с дозами 100 мг/кг или

5х20 мг/кг (одна доза в пять дней) не оказывает влияния на рост опухоли.

Легочная опухоль Льюиса.

Зп Эту епухоль трансплантируют в виде клеточной суспензии в бедренную мьппцу инбридных мьппей С5781 при числе клеток 10 . Растущая опухоль индуцирует регулярные метастазы легких.

Лечение начинают в день, следующий после дня трансплантации. Наблюдают выживаемость обработанных и контрольных животных.

В -меланома.

Опухоль транспзтантируют под шкУРУ

40 спины инбридных мьппей С5781 в виде кусочков опухолей, Рост опухоли индуцирует метастазы легких. Лечение н оценку действия проводят методом>

45 аналогичным описанному для случая легочной опухоли Льюиса.

Результаты, относящиеся к LLT и В -меланомам приведены в табл. 7.

Согласно полученным результатам

5р соединение II умеренно удлиняет время жизни животных включая LLT и В

У Я меланомы. Степень эффекта ингибирования практически равна эффекту

ВСИ7, Изучение опухолевых ксенографтов человека.

Кусочки серийно трансплантируемых опухолей (взрослая тимектомия, полное облучение с 8,5 Gy, перестройка

1414851

Объем обработан- ных" опухолей к

21-му дню — объем обработанной

Эффект ингиб„р „ МОО " О д " 100; опухоли Объем контрольной опухоли на

21-й день — объем контрольной опухоли в О день

30 (100 означает полное ингибирование роста опухоли). 35

Результаты экспериментов показывают, что пептидонитрозомочевинные производные значительно ингибируют рост амеланотических меланом,тогда как их влияние на рост опухолей тол- 40 стой кишки и поджелудочной железы несколько ниже (табл. 8), Опухоль-ингибирующий эффект N-нитрозо-(й-хлорэтил)карбамоилпептидных 45 фрагментов на лейкемию мьппей L 1210 приведен в табл. 9. в=с -сн, сн,и-с=о!

I 1

0N qg,, — не определялась.

50 мозгового вещества с помощью 5 10 сингенных медулярных клеток) трансплантируют под шкурку спины искусственно иммунодепрессированных мышей разновидности СВА/Са, 5

Внутрибрюшинное введение лекарст,; :ва начинают тогда, когда опухоли дос тигают диаметра 0,7" 1,0 см и можно

: наблюдать их прогрессирующий рост.

Диаметры опухолей измеряют кронцирку/ лем и их объем рассчитывают на осно" ве их диаметра. (Y = К/бхР, D — средний диаметр). Степень эффекта ингибирования опухоли определяют на осно вании разности объема опухоли измеренного на 21-й день после трансплантации в контрольной и обработанной группе (каждая экспериментальная группа включает по крайней мере шесть 2С опухолей).

Оценку опухоль-ингибирующего эффекта относительно L1210 проводят следующим образом, 10 клеток лейкемии L1210 внутрибрюшинно трансплантируют мышам. Лечение начинают в первый день после трансплантации, Соединения, подлежащие изучению, вводят в виде физиологического раствора (NaC1) или 2 .-ного буффера твин 80, содержащего 5 . диметилсульфоксида, Выживаемость Выживаемость обработанных контрольных

П.Б — "" ей — мышей

Выжив а ем о ст ь кон т роль ных мышей

Критерий: ILS % — значительный опухоль-ингибирующий эффект, Таким образом, на основании представленных данных можно заключить, что предлагаемые соединения являются эффективными цитостатическими агентами и что эти новые соединения являются более эффективными цитостатическими агентами, чем известное BCNY u хлорозотицин, Причем аналог по структуре; o(С =

-бис-(2-хлорэтил)карбамоил-Lys-Pro-Val-NH не обладает цистостатической активностью.

Определение токсичности предлагаемых соединений, проведенное на мышах вида С 57 BL х DBA, показывает, что они могут быть отнесены к категории среднетоксичных соединений.

Формула изобретения

- N-Нитрозо-N-(бета-хлорэтил)карбамоилпептиды общей формулы

NO ! (cl-сн,сн,нсснн R где п=1;

R — Lys Pro Val NH,, Trp Leu a Asp

Phe NH,, Pro Val NH,, Gly Lys Pro Val NH,, Trp Gly Lys Pro Val NH, или

n = 2; R — Lys Pro Val NH, нли их хлоргидраты, обладающие противоопухолевой активностью, 14 4851

16

Таблица 1

МЯТ- ффективность, %, Т/C**

Средний период выживания MST дни

Число

Испытуемое Доза, соединение IP мг/кг

Средняя потеря в весе на

5-й живых мьппей к 5-му дню (47) ень г — 1,4 6/6 (5)

-О, 8 6/6 (5) BCNY

Соединение I

6/6(-).

6/6(2)"

6/6(3) -1,5

-0,6

-0,8

Соединение II

150

100

40

Хлорозотнцин 48

16

9,0 150

+1,2

Физиологический

Контроль

+2 5 раствор

NaC1

*Обе мьппи больны.

ИЯТ обработанной группы х 100.

** ST контрольной группы

Т аблица 2

Дозировка (внутри- ?Ь$, брюшинно), мг/кг

Зх10

3 х 50

1х 133

1 х 200

150

Токсично

40 47,0 783

30 47р0 783

200 8 ° 5 142

130 12,0 200

70 47,0 783

10,5 175

47,0 783

29,5 492

13,0 217

14,0 233

8,5 142

47,0 783

20,5 342

-1,1

-0,7

-0,5

-0,7

-0,3

-1,3

-1,2

-0,8

6/6(1)

6/6(3)

6/6(2)

6/6 (-)

6/6(-)

6/6 (-)

5/6 (3)

6/6(-)

6/6 (-)

10/10(-) 1414851

18

Таблица3

Соединение

Доза, мг/кг

ПS 7.

28

50

100

Токсично

15

45

100

150

230

Таблица 4

Применение лекарства ILS X Выживание, Доза, мг(кг Дни Ж

12 5

50 0

325

325

1х25

7 II

8 Циклофосфамид

1х50

9 Дибромдульцит

10 BCNY

11 Лечение соответствует

7+ 8

1х50

1х10

77

12 Лечение соответствует

7+9

13 Лечение соответствует

7+ 10

14 II

15 BCNY

1х50

1х20

16 Лечение соответствует

14+ 15

Опыт С о единение

1 II

2 II

3 BCNY

4 BCNY

5 Лечение соответствует

2 + 3

6 Лечение соответствует

1 + 4

1 . 50

1 87

1 25

1 110

1414851

Т.аблица 5

Выживание***, 7о

ILS** Z

Лечение

Соединение оза, мг/кг Дни"

1 х12,5

1х50

1 х 133

1z25

44

45

250

110

*Внутрибрюшинно, применение в отмеченный день после трансплантации.

Время выживания обра- Время выживания необботанных мьппей — работанных мьппей

Время выживания необработанных мьппей х 100.

***Выживание на 60-й день после. трансплантации.

Т аблица 6

В -меланома

Опухоль Льюиса

Доза,мг/кг

Средняя дли- ILS 7 дельность выживания, дни

Средняя дли- ILS 7 тельность выживания, дни

21,0

26,0

Контроль

Соединение II

100

22,0

31,5

21,5

27,0

5х20

35,0

BCNY

28,5

25,0

42,0

34,0

5х4

1 х 25

1 х 100.

Зх10

3-х 50

4 х 10

1;5; 9

1;5; 9

1 i2 5s6

1414851

22

Табли а 7

LLT

Средняя выживаемость,дни

Лечение

ILS,%

ILS*,%

Средняя выживаемость,дни

26,0

Контроль

21 0

31,5

35 0

22,0

5%20

27,0

BC мг/кг

42,0 61

34,0 31

28,5

25,0

OILS - увеличение выживаемости.

Таблица 8 Эффект ингибирования опухоли, %

НТ18

50 мг/кг

Соединение формулы ЕХ 40

100 мг/кг 5х20 мг/кг

77 68

Соединение формулы 57

НТ17

Соединение формула II

НТ22

Соединение формулы II

НТ18

10 мг/кг

20 мг/кг

BC_#_Y

Таблица 9

Испытуемое соединение оза (внутрибрю шинн о г/кг г/кг

BCNY

0 028 55

О, 052 78 О, 112 .115

0,212 Токсично

20

КРгоЧ&1БН а

30 187,2

40

136

80%

100

Соединение II мг/кг:

100

О, 056

0,112

0,230

0,280

ILS,X Время 9у жизни мнн

1414851

23

Продолжение табл.9

ILS,Õ Время Ь оза (внутриб шинно

Испжуемое соединение

Йиэни, k-Lys-Pro-Ча1-NH,НС1

200

0,560

0,024

0,048

12,5

29,8

25,0

0,097

100

100

0,195 263

150

0,254

0 390

607.

R-Gly-Lys-Pro-Ча1-NH,НС1, 200

27 25,8

0,043

О, 087

О, 175

48

100

100

200

0,351

О, 015

0,030

0,061

R-Trp-G1y-Lys-Pro-Val-NH, НС1

19,9

100

300

100

О, 122

0,244

607.

200

60%

300

0,366

0,070

О 140

0,210 160

R-Trp-Leu-Asp-Phe-NH

nd

100

150

230

200

0,280

O, Р -бис(2-Хлорзткфарбаноил 1ув-Pro-Чаl-NH, 0,018

0,036

О» 144

0,109

0,085

20

50

Н-?.уз-Pro-Чаl-МН, -2СН, СООН

Н-Lye-Pro-Gly-Lys-Pro-Val-NH

50

Составитель В. Волкова

Техред М.Ходанич Корректор C. Шекмар

Редактор H. Яцола

Заказ 3845/26а Тираж 348 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4