Способ получения фруктозодифосфатальдолазы

Способ получения фруктозодифосфатальдолазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к энзимологии , точнее к вьзделению ферментов, и предназначено для научной и лабораторной практики при изучении роли фруктозодифосфатальдолазы в иммунитете при холере и для использования фруктозодифосфатальдолазы как возможного компонента противохолерной вакцины . Цель изобретения - повьш1ение степени очистки. Для этого холерные вибрионы инактивируют 6-кратным замораживанием-оттаиванием , центрифугируют . Проводят механическую дезинтеграцию клеток со стеклянным песком, экстрагируют гомогенат 0,005 М трис- НС1-буфером рН 7,6, снова центрифугируют . Затем проводят дробное фракционирование , осадок растворяют и диализуют против 0,005 М трис-НС1-буфера рН 7,6, проводят ионообменную хроматографию - очистку на ДЭАЭ-целлкшозе при элюции линейным градиентом 0,5 М NaCl рН 7,6, Полученные порции элюата спектрофотометрируют при А 280 нм и строят хроматографический профиль. Полученные 5 пиков излучают на ферментативную актцрность. Фруктозодифосфатальдолазной активностью обла- . дают 4-й и 5-й пики, которые объединяют и изучают на антигенные и иммуногенные свойства. (/)

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) А1 и) 4 С 12 Р 21/00

ХЕСОИ! -.=:, ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 39 51983/28-14 (22) 11.09.85 (46) 15. 09. 88. Бюп. В 34 (71) Всесоюзный научно-исследовательн 11 ский противочумный институт Микроб (72) Н,В. Майоров, Н,Г. Тихонов и А.К. Адамов (53) 612.015(088.8) (56) Практическое руководство по энзимологии. M. Высшая школа, 1980, с. 133-137. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФРУКТОЗОДИФОСФАТАЛЬДОЛАЗЫ (57) Изобретение относится к энзимологии, точнее к выделению ферментов, и предназначено для научной и лабораторной практики при изучении роли фруктозодифосфатальдолазы в иммунитете при холере и для использования фруктозодифосфатальдолазы как возможного компонента противохолерной вакцины. Цель изобретения — повышение степени очистки. Для этого холерные вибрионы инактивируют 6-кратным замораживанием-оттаиванием, центрифугируют. Проводят механическую дезинтеграцию клеток со стеклянным песком, экстрагируют гомогенат 0,005 М трисНС1-буфером рН 7,6, снова центрифугируют. Затем проводят дробное фракционирование, осадок растворяют и диализуют против 0,005 М трис-НС1-буфера рН 7,6, проводят ионообменную хроматографию — очистку на ДЭАЭ-целлюлозе при элюции линейным градиентом 0,5 М

NaC1 рН 7,6, Полученные порции элюата спектрофотометрируют при % 280 нм и строят хроматографический профиль.

Полученные 5 "пиков" излучают на ферментативную активность. Фруктозодифосфатальдолазной активностью обла- . дают 4-й и 5-й "пики", которые объеди. няют и изучают на антигенные и иммуногенные свойства.

1423551 2

Изобретение относится к энзимологии, а именно к вьделению ферментов, и может быть использовано в научной и лабораторной практике для изучения роли фруктозодифосфатальдолазы в иммунитете при холере, а также использование как возможного компонента противохолерной вакцины.

Цель изобретения — повышение сте10 пени очистки.

Пример. Культуру холерных ,вибрионов классического биовара, серо;вара Инаба, штамм 5693 выращивают

la течение 8-10 ч в 250-литровом ре15 акторе-ферментере в условиях аэрации при 34-36 С глубинным методом на бульоне из ферментативного гидролизата казеина рН 8,0, соцержащего

200 мгЖ аминного азота, 2Е пептона, О, 57 NaC1, 0,057-ного 2-замешенного фосфата натрия . Культи вир ова ни е ви б"

1 авионов продолжают до концентрации 55-65 млрд, микробных клеток в 1 мл (в соответствии с регламентом произ водства холерной вакцины "Холерогенанатоксин + 0 — антиген"), переносят иидкую реакторную культуру в объеме, 2,5 л в стеклянную бутыль, емкостью.

3 л и помещают в низкотемпературный олодильник для замораживания. Замоаживание проводят при -25 С в течеие 48 ч (в низкотемпературном холоьнике Грюнланд ГДР, модель

-12,5/0,1), оттаивание при комнатой температуре в течение 30 ч. Посе окончания шестикратного цикла замораживания-оттаивания и постановки гестов на жизнеспособность вибрионов культуральную жидкость центрифугируЮт с целью вьделения вибрионов из среды при 6000g в течение 30 мин на центрифуге ЦЛР-1. Надосадок отбрасыВают, осадок клеток в объеме 120 мп

Переносят в фарфоровую ступку, соединяют с равным объемом стеклянного

45 песка и растирают в течение 20 мин.

По окончании процедуры в ступку вносят рабочий буфер (0,005M. трис-НС1 рН 7,6) в объеме 240 мл, перемешивают, дают стеклянному песку осесть и надосадочную жидкость (360 мл) переносят

: центрифужные стаканы. Клеточный экстракт центрифугируют при 600Og в речение 30 мин для удаления фрагмен гов разрушенных клеток. После центри- 5 фугирования надосадок в объеме 350 мл переносят в колбу, осадок, состоящий

)из разрушенных клеток вибрионов, отбрас ывают. Бескл еточ ный экстракт насыщают сернокислым аммонием вначале до 307 путем внесения в колбу с экстрактом сухой col.и из расчета 180 г/л, растворяют перемешиванием и центрифугируют для отделения образовавшегося осадка при 6000g в течение 20 мин.

После этого надосадочную жидкость (350 мл) переносят в колбу (осадок

40 мл,. содержащий балластные вещества, отбрасывают) и вновь насыщают сульфатом аммония до iOOX (от 30 до

1007) из расчета 510 г/л, растворяют внесенную соль (178,5 г) перемешиванием и центрифугируют с целью отделения осадка при 6000g в течение

20 мин. Надосадочную жидкость отбрасывают, осадок в объеме 30 мл, содержащий фермент, помещают в диализатор и диализуют против рабочего. буфера в течение 24 ч. При обессоливании происходит увеличение объема содержимого диализатора за счет гидрофильных свойств белка до 130 мп. По окончании диализа препарат фильтруют через бумажный фильтр (для удаления крупных частиц) и наносят на колонку размером 2,5-50 см с ДЗАЗ-целлюлозой, уравновешенной рабочим буфером.

Сорбцию ферментсодержащего белка на целлюлозу проводят со скоростью

40 мп/л. Элюцию осуществляют в объеме

1 л 0,5М NaC1 в рабочем буфере со скоростью 20 мл/ч. Фракции собирают на автоматическом коллекторе фракций

ХКОВ-1 по 5 мп в пробирку. Полученные порции элюата спектрофотометрируют при 280 нм на СФ-26, по полученным данным строят хроматографический профиль. Полученные 5 - пиков" изучают на ферментативную активность. Фруктозодифосфатальдолазной активностью обладают четвертый и,пятый "пики".

Наиболее активные порции (четвертый и пятый "пики") объединяют и изучают на антигенные и иммуногенные свойства.

Таким образом, способ позволяет повысить степень очистки более, чем в 3 раза.

Формула изобретения

Способ получения фруктозодифосфатальдолазы путем экстракции сырья, фракционирования сульфатом аммония, ионообменной хроматографией, о т л и.—

Составитель Т. Забойкина

Техред А.Кравчук

Корректор О. Кравцова

Редактор И. Сегляник

Заказ 4603/28 Тираж 520

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская паб., д. 4/5

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4, з

142355 ч а ю шийся тем, что, с целью повышения степени очистки, холерные вибрионы инактивируют шестикратным замораживанием — оттаиванием центриФ

5 фугируют, клетки механически дезинтегрируют со стеклянным песком, экстрагируют гомогенат 0,005 М трис-НС11

4 буфером рН 7,6, центрифугируют, фракционируют дробно сернокислым аммонием, осадок растворяют, и диализуют против 0,005 М трис-HCl-буфера рН 7,6 и очищают на ДЭАЭ-целлюлозе при элюацни линейным градиентом 0,5 М хлористого натрия рН 7,6.