Способ определения таксономической принадлежности микроорганизмов

Способ определения таксономической принадлежности микроорганизмов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к микро - биологии. Цель изобретения - ускорение способа. Исследуемую суспензию микроорганизмов разделяют на несколько проб, в которые добавляют различные флуорогенные субстраты, расщепляемые внутриклеточными ферментами микроорганизмов . После инкубации определяют величину флуоресценции каждой пробы, строят профиль исследуемой суспензии и сравнивают с контролем, выбирают наиболее близкий профиль и определяют таксономическую принадлежность микроорганизмов. 1 з.пф-лы, 2 ил.

С0103 СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„„1440917 А 1 (ц 4 С 12 N 1/20//С 12 1/02!

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21 ) 4244258/28-13 (22) 12.05.87 (46) 30.11.88. Бюл. У 44 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт биологического приборостроения (72) С.В.Газенко (53) 576.8.093,!{088.8) (56) У. Analytical Chemistry, 1985, 57, р, 1669-1673. (4) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТАКСОНОМИЧЕСКОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ (57) Изобретение относится к микро" биологии. Цель изобретения — ускорение способа. Исследуемую суспензию микроорганизмов разделяют на несколько проб, в которые добавляют различные флуорогенные субстраты, расщепляемые внутриклеточными ферментами микроорганизмов. После инкубации определяют величину флуоресценции каждой пробы, строят профиль исследуемой суспензии и сравнивают с контролем, выбирают наиболее близкий профиль и оп- ределяют таксономическую принадлежность микроорганизмов. 1 з.н ф-лы, 2 ил.

1440917

Изобретение относится к микробиологии, в частности для быстрой идентификации микроорганизмов в медицинской микробиологии и выявления промьпп5 ленных загрязнений в биотехнологии.

Цель изобретения — повышение чувствительности и ускорение способа.

Способ иллюстрируется следующими примерами . 10

Пример 1. К 3 мл суспензии клеток Е. coli М-17 с концентрацией

10 кг/мл, приготовленной на физиологическом растворе добавляют 0,3 мл раствора 4-метилумбеллиферилфосфата (0,1 мг/мл в диметилсульфоксиде) к трем другим аналогичным пробиркам добавляют раствор 4-метилумбеллиферилацетата, 4-метилумбеллиферилбултирата, 4-метилумбеллиферилпальмитата. 20

Исследуемые пробы помещают в водяную баню при 40 С на 15 мин, после. чего

0 быстро охлаждают до 4-5 С и фпуориметрируют. Длину волны возбуждений флуориметра устанавливают на 320 кк, 25 члина волны флуоресценции 450 нм.

По полученным величинам флуоресценции каждой пробы строят профиль исследуемой суспензии клеток, который сравнивают с предварительно получен- . 30 ными профилями, выбирают наиболее близкий к полученному и делают вывод о таксонономической принадлежности клеток (фиг. 1).

Пример 2. Суспензия клеток

В. thuringiensis (концентрация

10 кл/мл), выращенную на МПА 17 ч и приготовленную на физиологическом растворе, разливают в трй пробирки по

3 мл в каждую. К первой добавляют 40

0,3 мл раствора 4-метилумбеллиферилфосфата (с концентрацией 0„1 мг/мл на д метилсульфоксиде), к второй 0,3 мл раствора флуоресцеиндиацетата (0,1 мг/мл на ацетоне), к третьей

О, 3 мл раствора резаэурина (0,1 мг/мл на дистиллированной воде). Получено ные смеси инкубируют 15 мин при 40 С о на водяной бане, охлаждают до 5-6 С

H флуориметрируют: пеРвый Раствор 5О 1 цо :320 нм 3фл =450 ими второи Врэд=

=470 нм, rl@ =515 нм, третий раствор

Л „=520 нм, Я, л,=570 нм. Строят профиль величин флуоресценции, по которому судят о таксономической принадлежности исследуемой культуры клеток (фиг. 2) . Для простоты измерения мож" но испольэовать одну общую для всех красителей it . возбуждения (ближний ультрафиолет), Использование флуоресценции позволяет определять исключительно малые концентрации клеток, так как чувствительность может быть ирактически неограничено повьппена за счет увеличения интенсивности возбуждающе-. го фпуоресценции света (использование более мощных ламп, лазеров) и увелиучения времени инкубапии клеток с субстратом,, Способ может найти применение в е практике санитарно-бактериологических лабораторий для быстрого и точного определения видовой принадлежности выросших на питательных средах микроорганизмов по полученным профилям,в частности для определения малых количеств санитарно-значимых микроорганизмов в пробах воды, воздуха, продуктов или пробах, взятых с поверхностей.

Используемые известные практике методы требуют затрат времени на определение от нескольких часов до нескольких суток. Использование предлагаемого способа, при сохранении надежности определения составляет 10-30 мин.

Формула изобретения

1. Способ определения таксономической принадлежности микроорганизмов путем инкубирования отдельных проб исследуемой суспензии с флуорогенными субстратами с последующим определением таксономической принадлежности микроорганизма по величине фпуоресценции, полученной в результате взаимодействия ферментов микроорганизмов с субстратом, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения чувствительности и ускорения способа, в качестве фпуорогенных субстратов используют вещества, расщепляемые внутриклеточными ферментами микроорганизмов.

2 ° Способ о п. 1, о т л и ч аю шийся тем, что в качестве флуорогенных субстратов используют

4-метилумбеллиферон, 4-метилумбеллиферилацетат, 4-метилумбеллиферилпирофосфат, 4-метилумбеллиферилсульфат, резазурин и/нли фпуоресцеин.

1440917

Составитель А.Завадская

Техред M.ДИдык

Редактор M.Íåäoëóæåíêî

Корректор И.Муска Тираж 520

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5

Заказ 6141/28

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4