Способ получения d-фенилаланил-l-пролил-l-аргининальдегид сульфата
Патент 1442078
Авторы
Способ получения d-фенилаланил-l-пролил-l-аргининальдегид сульфата
Иллюстрации
Реферат
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНих
РЕСПУБЛИН
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ. 0 „„ 442О78 (51)4 С 07 К 5/08 // A 61 К 37/02.(21) 3374350/23-04 (22) 13,01,82 (31) 70/81 (32) 13. 01.81 (33). HU (46) 30.11.88. Бюл. И- 44 (71) Рихтер Гедеон Ведьесети Дьяр PT (НЦ) (72) Шандор Байюс, Эржебет Селл, Ква Барабаш и Даниел Багди (HU) (53) 547.964.4.07 (088.8) (56) Ondetti М.А. и др,"Design 6f
specific .inhibitors of angiotensinconverting enzyme: пеш class of
orally active antihypertensive,:
agents" Science, ч. 196, р.441,1977.
Патент Венгрии 169870 кл. С 07 С 103/52, опублик. 1977. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Р-ФЕНИЛАЛАНЙЛL-ПРОЛИЛ-L-АРГИНИНАЛЬДЕГИД СУЛЬФАТА (57) Изобретение касается производства пептидов, в частности получения сульфата D-фенилаланил-L-пролил-Lаргининальдегида, проявляющего биологическую активность, что может быть использовано в медицине. Цель изобретения — создание нового более активного и малотоксичного пептида.
Его синтез ведут из блокированного
Вос-группой указанного альдегида или его полусульфата, который подвергают деблокированию обработкой 8-12"кратным эквивалентным количествам 512 н, Н S0 при 40-60 С в течение
10-20 мин с последующей нейтрализацией раствора и выделением целевого продукта. Выход 797, Eî(3 > (-117 ) 8,1 (с=1, в воде), брутто ф"ла
С1 H> Og N q Н ВО ЗН О .О, 2 Са$0 а, мол.м. 565,85. Новый пептид обладает хорошей стабильностью при хранении в водных растворах. Так, в сравнении с известными солями указанного пепти-. да антитромбиновая активность сохраняется до 180 дней против 5 дней при токсичности LD =960 >i2000 Mr/êã.
fa
4 табл.
1442078
Изобретение относится к способу получения В-фенилаланил-L-пролил-Lаргининальдегид сульфата - нового биологически активного соединения, которое может найти применение в медицине, Цель изобретения — способ получения новых соединений в ряду малотоксичных пептидов, обладающих высокой антитромбогенной активностью, сохраняющейся в течение длительного времени при хранении в водных растворах.
При осуществлении способа контроль 1 за чистотой продуктов осуществляют с помощью хроматографии в тонком слое силикагеля G (Реанал, Будапешт) в следующих системах растворителей:
Этилацетат-пиридин-уксусная кисло20 та-вода 480: 20: 6: 11;
Этилацетат-пиридин-уксусная кисло" та-вода 60:20:6:11;
Этилацетат-пиридин-уксусная кислота"вода 30:20:6:11.
Пример 1. D-фенилаланил-?пролил-L-аргининальдегид сульфат.
1.
2, 74 г (5 ммоль) трет-бутоксикарбонил-D-фенилаланил-L-пролил-Ьаргининальдегид полусульфата раство30 ряют в 5 мл воды, при перемешивании добавляют 5 мл 10 н, серной кислоты, о смесь нагревают до 50 С. Раствор перемешивают в течение 15 -мин при этой температуре, затем разбавляют 25 мл ледяной воды и с помощью твердого карбоната кальция (примерно 2,25 r) устанавливают значение рН, равное
6,5.
Выпавший в осадок сульфат кальция 40 отфильтровывают и промывают 2 раза по 5 мл водой. Фильтрат дважды встряхивают с 10 мл н-бутанола, концентрируют его при пониженном давлении примерно до объема 30 мл, желательно 45 фильтруют и лиофилизируют. Получают
2,25 r (797.) указанного в заголовке соединения, которое содержит 4,87. сульфата кальция. R <=0,35-0,40, (/3 =-117 +81 (с=1, в воде).
Вычислено, 7.: С 42,45; Н 6,77, N 14,85; S0, 20,37; Са 1,41; Н О 9,55.
С,Н„О N, Н,SO ЗН О 0,2 Са$0 (мол,м. = 565,85)
Найдено, 7.: С 42,2 Н 6,9; И 14,85 55
SO 198; Са 1,3, Н О 975 °
Стадия 1. Трет-бутилокси-карбонилD-фенилаланил-L — ïðoëèë-Ü -бензилокси1б карбонил-!.-а ргиннн-пактам.
8,6 r (22 ммоль) трет-бутилоксикарбонил-N ""бензилоксикарбонил-L— с аргинин-лактама суспендируют в 20 мл о этилацетата при 5 С и при перемешивании добавляют 40 мл 4 М содержащего этилацетат раствора соляной кислоты.
Реакционную смесь при охлаждении ледяной водой перемешивают в течение
30 мин, затем разбавляют 100 мл охлажденного этилацетата, выпавший оса" док отфильтровывают, промывают этилацетатом и сушат над гидроксидом калия в вакуумном эксикаторе.
Я
Таким образом полученный N "бензилоксикарбонил-1-ар гининлактам-хлоргидрат растворяют в 20 мл диметилформамида и после охлаждения до -10 С добавляют 6,2 мл (44 ммоль) триэтиламина. Полученную суспенэию добавляют к следующему ангидриду.
7,25 г (20 ммоль) трет-бутилоксикарбонил-Р-фенилаланил-L-пролина и 2,22 мл (20 ммоль) N ìåòèë-морфо лина растворяют в 20 мл диметилфоро мамида. Раствор охлаждают до -15 С и при перемешивании добавляют
2, 64 мл (20 ммоль) иэ обутилово го эфира хлоругольной кислоты, потом спустя 5 мин добавляют вышеуказанный раствор диметилформамида. Реакционную смесь далее перемешивают в течение.часа при — 15 С и в течение часа при 0 С. Затем разбавляют 30 мл бензола, выпавшие в осадок соли отфильтровывают и промывают дважды по
10 мл бензола. Содержащий бензол диметилформамидный раствор разбавляют
50 мл воды и фазы разделяют. Водилою фазу экстрагируют дважды по 10 мл бензолом, затем объединенные, содержащие бензол растворы промывают последовательно трижды по 30 мл 107.-ным раствором карбоната натрия, 30 мл воды, трижды по 30 мл 0,5 н, серной кислоты и дважды по 30 мл воды, потом после высушивания над безводным сульфатом натрия выпаривают при пониженном давлении. Остаток после выпаривания растирают с петролейным эфиром, отфильтровывают, промывают петролейным эфиром и сушат на воздухе. Получают 9,65 г (767) указанного в заголовке соединения.
R =0,81 — 0,89.
1
Стадия 2, Трет-бутилокси-карбонилD-фенилаланил-L — ïðîëèë-N --Гензилокси.G кар бонил-L-ар гини вал ьпе гир . акции катализатор отфильтровывают, промывают 30 мл 50Х-ного водного тетрагидрофурана, затем концентрируют фильтрат при пониженном давлении
5 до объема примерно 60 мл. Остаток экстрагируют четыре раза по 40 мл бутанолом. Если водная фаза содержит указанный в заголовке продукт (R =
=0,45-0,54), то добавляют 5 мл тетрагидрофурана и ее дважды-трижды экстрагируют 40 мл н-бутанола, í-бутанольные фазы объединяют и выпаривают досуха при пониженном давлении.
Остаток после выпаривания растирают со смесью 1: 1 диэтиловый эфир-диизопропиловый эфир, отфильтровывают и промывают вышеуказанной смесью, потом сушат в вакуумном эксикаторе, Получают 4,4 г (80Х) указанного в заголовке продукта. RE=0,45-0,54.
Cd 1 =-65 + 10 (c=1, в воде) .
Вычислено, Х: С 54,43; Н 7,13;
N 15 23; 80с 8 71 °
С,Н О Ч, 0,5HgSOg (551,64)
Найдено, Х: С 54,5; Н 7,3;
N 15 2; ЯО+ 8,7.
Пример 2. Получение П-фенилаланил-L-пролил-L-apгининальдегид
ЗО су фата
2 85 r (5 ммоль) трет-бутилокси1
С» карбонил-Э-фенилаланил-L-пролил-N— карбокси-Ь-аргининальдегида растворяют в 5 мл воды, при перемешивании
:.добавляют 5 мл 10 н, сеуной кислоты.
Зб.Раствор нагревают до 50 С, в течение
15 мин нагревают при 50 С, затем разбавляют- 25 мл ледяной воды и при охлаждении ледяной водой с помощью
40 . твердого гидроксида кальция (необхо. димо примерно 1,6 .г) устанавливают рН равным 6,5. Выпавший в осадок сульфат кальция отфильтровывают и промывают дважды по 5 мл водой.
Фильтрат экстрагируют дважды по 10мл
4В н-бутанолом, затем концентрируют при пониженном давлении примерно до объема 30 мл, в случае необходимости отфильтровывают, наконец лиофилизируют.
Получают 2,3 г (81Х) указанного в заб0 готовке продукта, который содержит
4Х сульфата кальция. Б. =0,35"0,40.
l 3 > =117 + 1 (с=1, в воде).
Исходное вещество получают следующим образом.
55 6,4 г (10 ммоль) защищенного трипептидальдегида (пример 1, стадия 2) гидрируют в 100 мл 75 -ного водного этанола и в присутствии 1 r 10X-ного
1442078
9,52 r (15 ммоль) защищенного трипептид-лактама (стадия 1) растворяют в 45 мл тетрагидрофурана при о
-20 С и при интенсивном перемешивании добавляют содержащий 11,25 ммоль литийалюминийгидрида тетрагидрофурановый раствор LiA1H < (примерно 28 мл
0,4 М раствора). Течение восстановления контролируют с помощью тонкослойной хроматографии (R - значение лактама составляет 0,71-0,77, а альдегида " 0 31-0,39) и, если необходимо, можно добавлять дальнейшее количество раствора гидрида. По окончании реакции тетрагидрофурановый раствор осторожно подкисляют 0,5 н. серной кислотой до рН=З, затем, разбавляют водой так, чтобы вещество не осадилось (примерно 100 мл). Потом его дважды экстрапируют по 30 мл гексана. Водный содержащий тетрагидрофуран раствор трижды встряхивают с 75 мл метилен" хлорида, затем объединенные метиленхлоридные растворы промывают трижды по 10 мл 10 .-ным раствором карбоната натрия и дважды по 10 мл водой.
После этого содержащий метиленхлорид раствор сушат над безводным сульфатом натрия и выпаривают при пониженном давлении. Остаток после выпаривания растворяют в 50 мл бензола, и раствор снова выпаривают при пониженном давлении. Растворение в бензоле и выпаривание повторяют еще один раз.
Таким образом полученный остаток после выпаривания растирают с диэтиловым эфиром, отфильтровывают, промывают диэтиловым эфиром и сушат на воздухе. Получают 6,9 г (72 ) указанного в заголовке соединения R =0,30,4.
Г
Стадия 3. Трет-бутилокси-карбонил-D-фенилаланил-.L-пролил-L-ар гининальдегид полусульфат.
6,4 г (10 ммоль) защищенного трипептид-альдегида (стадия 2) растворяют в смеси 50 мл воды, 50 мл тетрагидрофурана и 10 мл 1 н. серной кислоты, затем в присутствии 1 r 10 ного палладия на активном угле в качестве катализатора гидрируют. За течением реакции следят с помощью
1 тонкослойной хроматографии (R
f значение защищенного по своей гуани" дино-группе трипептид-альдегида составляет 0,95-1,0 и К вЂ” значение свободного трипептид-альдегида составляет 0,45-0, 54).. По окончании ре1442078
40 палладия на активном угле в качестве катализатора. За течением реакции следят с помощью тонкослойной хроматографии (R g — значение защищенного трипетидальдегида и N -карбокси-проа» 5 изводного составляет, соответственно, 0,90-0,95 и 0,45-0,55). По окончании реакции катализатор отфильтровывают, промывают 30 мл воды, затем фильтрат концентрируют при пониженном давлении др объема 30-40 мл. Остаток разбавляют 100 мл воды, экстрагируют дважды по 20 мл метиленхлоридом и диофилиэируют. Получают 5,1 r (85%) указанно го в заголовке продукта. 8<0,45" 1, 0,55. Аминокислотный анализ: Phe=0,96;
Pro — 1 (в расчете на основу). Полученный в условиях примера 2 В-фенил" 20 аланил-L-пролил-L-аргининальдегид сульфат имеет состав С,Н 0>N ЗН. О"
«0,2 СаБО (мол.масса 565,85).
Вычислено, %: С 42,45; Н 6,77;
М 14,85; БО 21,13; Са 1;43; 2б
Н,О 9,55.
Найдено, %: С 42,30; Н 6,85;
N 14,80; SOq 20,90 Са 1,35 я О 9,70.
П р.и м е р 3. D-фенилаланил-Ьпролил-L-аргининальдегид сульфат.
Процесс ведут в условиях, описанных в примере 1 с той разницей, что
2,74 r (5 ммоль) трет-бутилоксикарбонил-Ь-пролил-L-аргининальдегид поЗВ, лусульфата растворяют в 10 мл 5 н. серной кислоты, раствор перемешивают при 60 С в течение 10 мин. Получено ный продукт идентичен продукту, полу ченному в примере 1.
Пример 4. D-фенилаланил-Ьпролил-L-аргининальдегид сульфат.
Поступают по примеру 2 с той толь ко разницей, что раствор, содержащий
5 мл 12 н. серной кислоты перемеши.У
45 вают при 40 С в течение 20 мин.
Пример 5. Получение фармацевтического препарата.
Препарат в двух ампулах, который пригоден для б-12-часового вливания, готовится следующим образам . 420840 мг D-фенилаланил-L-пролил-L-аргининальдегид сульфата в качестве биологически активного вещества и
40-80 мг человеческого альбумина лиофилиэируют вместе, Содержимое таким образом лиофилиэированной ампулЫ перед применением растворяют в 100200 мл стерильного, не содержащего пирогена, изотонического раствора поваренной соли.
Найдено, что стабильность различ. ных солей D-фенилаланил-L-пролил-Ь" аргининальдегида в водном растворе, например в физиологическом растворе поваренной соли, очень различна. При проводимых исследованиях пептиды растворяют в концентрации 1О мг/мл и изменение антитромбинной активности растворенных веществ .наблюдают в течение 180 дн. Растворы хранят о при 5 С. Значения активности устанавливают в системе, которая состоит из следующих компонентов: 0,2 мл 0,5%ного фибриногена крупного рогатого скота в 0,9%-ном растворе поваренной соли; О, 1 мл буфера трис(оксиметил)амико-метан-хлоргидрат-соляная кислота (рН 7,2), который содержит раствор пептида; 0,1 мл VS стандартного человеческого тромбина (NIH Мэриленд, США), 10 ед./мл раствора.
Время свертывания крови системы без пептида составляет 15, как определено в коагулометре "SchnitherGI 0SS". Активность трипептидальдегид" ной соли оценивают как 100, если при конечной концентрации реакционной смеси 3,5х10 М (в случае трипептидальдегид сульфата О, t75 мкг/мл реакционной смеси)1 было достигнуто 5кратное относительное время свертывания крови.
Результаты исследований представ- лены в табл. 1.Из. нее следует, что в то время как первоначальная активность соответствующего хлоргидрата в физиологическом растворе йоваренной соли начинает падать спустя 5 дней, активность ацетата, цитрата, тартрата, а также тозилата начинает падать уже спустя несколько дней (подобными свойствами обладает также N -карбокси"производное трипептидальдегида);
D-фенилаланил-L-пролил-L-аргининальдегид сульфат сохраняет свою антитромбинную активность спустя 90 дн.
При длительных (пролонгированных) исследованиях стабильности оказалось, что D-фенилаланил-L-пролил"L-аргининальдегид сульфатдаже спустя 180 дн в водном растворе еще стабилен и в твердом состоянии он через б мес не теряет своей активности.
Антитромбинная активность равна
100, если пептидальдегид в конечной концентрации реакционной смеси 3,5 «
2078 снг снг снг мн
1 1 ,.Н 504 НГгРЬЕ-Ь-Р о-ггНСН НН-С
; г
1 сно МН7
35 отличающийся тем, что
: соединение формулы си 7
Сиг СН7 718
1 1 ем-вРье-ь-Ро-ггн-сн мн-с
1 Ян7
40 сно
° ь,ьгггso, или формулы сн7 г снг сн 7
1 кн
45 . Bae-ВРгге-Ь-рро-МН-СН ггн-С
I ннсоск снО деблокируют, обрабатывая 8-12-эквивалентным количеством 5-12 н. серной кислоты при 40-60 С в течение 1050 20 мин с последующей нейтрализацией раствора и выделением целевого продукта.
144
e10 М вызывает пятикратное относительное время свертывания крови.
Подобно, как в случае ацетата, изменяется антитромбинная активность соответствующего цитрата, тартрата и тоэилата.
Антитромбинная активность солей трипептидальцегида, а также производного карбаминовой кислоты также исследовалась на человеческой плазме, которая лучше соответствует биологическим условиям в следующей системе:
О, 2 мл человеческой цитратной плазмы;
0,1 мл буфера три(оксиметил)-аминометан-хлоргидрат-соляная кислоты (рН=7,2), который также содержит пептидный раствор; 0,1 мл VS стандартно
ro человеческого тромбина (N1H, Bethesda, Мэриленд, США), 10 ед./мл раствора.
Время свертывания крови системы определялось без пептида в 15 с "коа" гулометре Schnither-Gross".
Из данных табл.2 видно, что необходимое для удлинения вдвое времени контрольногго свертывания крови количество пептида в случае ацетата и хлоргидратных солей зависит от загрузок и многократность также в случае карбаминовой кислоты составляет .уд- . .военное количество количества трипептидальдегид сульфата.
Результат исследований ин виво производных трипептидальдегидов представлен в табл.З, Антитромбинное действие Р-фенилаланил-Ь-пролил-L-аргининальдегид сульфата ин виво также л очень большое. При внутривенном и подкожном введении оно достигает действия вообще используемого в терапии гепарина, по сравнению с гепарином достигается даже повьппенное действие (плюс-действие). В то время как гепарин перорально неактивен с помощью .трипептидальдегид сульфата при оральной дозе 25 мг/кг можно достигать терапевтического действия {с помощью карбаминовой кислоты — только в дозе"
50 мг/кг).
Данные по токсичности D"ôåíèëàëàнил-Ь -пролил-Ь-аргининальдегид суль фата положительнее, чем данные по токсичности ацетата, а также данные по токсичности производного карбами новой кислоты. В табл,4 приведены значения острой токсичности, которые в случае трипептидальдегид сульфата в случае мьппей дают значение более чем 2 r/êã.
Иэ-за низкой токсичности и высо10 кой активности D-фенилаланил-L-пролил-L-аргининальдегид сульфата соотношение между лечебной и вредной дозбй лекарства намного предпочтительнее, чем таковое остальных трипептид1> альдегидных.
На основании исследований при внутривенном вливании собакам выявле- но, что цоэа для внутривенного влива" ния человеку составляет 1-2 мг/кг/ч.
Проведенные испытания показали, что D-фенилаланил-L-пролил-L-арги" нинальдегид сульфат, полученный в условиях предлагаемого способа, сое" динение малотоксичное, обладает высо"
2б кой антитромбогенной активностью, сохраняющейся длительное время при хранении соединения в водных растворах. Формула и э о б р е т е н и я
Способ получения D-фенилаланил-Ь-, 30, пролил-L-аргининальдегид сульфата формулы
1442078
Таблица i
Пептидальде гид
Относительная активность спустя, дн
) I I
70-50 60-40 40-30 40-30 40-30 35-25 30-20
90-60. 90-60 80-50 70-40 60-40 50-30 40-30
Р-фен-про-арг(СООН)-Н
100 80 60 50 30 25 20
100 100 100 100 100 100 100
D-фен-про-ар гн,н so„
Таблица 2
«е 1
Пептидальдегид
100
0,020
D-фен-про-аргН.Н ЯО
Р-фен-проарг-(СООН)-Н
0,042
D-фен-про-аргН.2CH СООН
0,065-0,140
35-14
D-фен-про-ар гН. 2HCI.
0,060-0,130
33-15 гепарин
0,105 19
Значения, полученньй. с коммерческим 132,2,2 ед/мг, VS РЬ ХУП/гепарином.
Таблица 3
Доза, мг/кг/ч, внутривенное вливание
Пеп тидал ьд е гид
Доза, мг/кг
Перорально
Подкожно
Кролик Собака
Кролик Собака Кролик Собака
D-фен-про-apr-Í.2СН СООН
D-фен-про-арг-Н,2HCl.
Р-фен-про-арг(COÎH)-H
100 100
100
3,0
10,0
6,0
50 50
25 25
Р-фен-про-арг-H,?! БО
6,0
1,0
0 5
6,0
0,6
0,5
5 0
2,0 гепарин
ll р и и е ч а я и е. Терапевтическое действие характеризуется 1 5кратным удлинением всего времени свертывания крови.
D-фен-про-ар гН.2СН СООН
D-фен-про-аргН,2 НС1
Необходимое для удаления вдвое времени свертывания крови количество реакцйонной смеси непосредственно после растворения пептида
Относительная активность
1442078
Табли ца 4. ЛД „мг/zr
Пептидальдегид
38 — 960
1200
45 730 1800 )2000 никаких литературных данных
Данные по токсичности для других форм введения с соответствующей гарантией не приведены;
При одночасовом внутривенном вливании в случае кроликов )ЛД равна 58 мг/кг.
Составитель В.Волкова
Редактор A,Долннич Техред А.Кравчук Корректор M.Màêñèèèøèíåö
Тираж 348 Подписное
ВПИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
ll3035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Заказ 6298/58
Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4
D-фен-про-арг-Н.2СН СООН
D-фен-про-арг(СООН)-Н
D-фен-про-арг-Н.Н БО гепарин
Внутри- Интра- Под- Оральвенно перито- кожно но неально