Способ получения рестриктазы ai и i

Способ получения рестриктазы ai и i

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСН ИХ

РЕСПУБЛИК

А1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Aha

4ь

Ж

СЛ

QO

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ 1 ННТ СССР (2 l ) 4 194840/28-1 3 (22) !6.02.87 (46) 07.01. 89. Бюл. N - 1 (7.1) Научно-производственное объединение "Биолар" и Всесоюзный научноисследовательский институт молекулярной биологии (72) И.Я.Хейслере, С.X.Äåãòÿðåâ, Ю.Н.Бойков, В.Е.Репин и Н.А.Божко (53) 577. 15(088.8) (56) Roberts R.J. Myers P.À., Morrison А., Murray К.А. Specific endonuc"

lease from Arthrobacter luteus. — J.

Molqc. Biol., 1976, v. 102, Р р. 157-165.

Clarke С.M., Hartley Б,С. Purification, properties and, specifity of

the restriction endonuclease from

Bacillus stearothermophilus." Bio"

chem, J., 1979, v. 177, р. 49-62 °

George J, Chrikjian I.Ñ. Biospecific fractionation matrix for seg"

nence — specific endonucleases.Nucleic Acids Res., 1978, v. 5, р. 2223-2232.

Green P.J., Heyneker Н.Ь., et а1.

А general method for the purification

of restriction enzymes. — Nucl Ас, Res., 19?8, ч. 5, N 7, р. 2373-2380.

„„SU„„1449582

gg 4 С 12 N 9/14 (C 12 N 9/14, С 12 R 1;06) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕСТРИКТАЗЫ, Alu1 (57) Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения рестриктазы, Alu1 из клеток бактерий :.

Arthrobacter luteus. Целью изобретения является повышение стабильности рестриктазы Alui и увеличение выхода целевого продукта. Разрушение клеток проводят в присутствии б-8Х-ного раствора яичного масла в органическом растворителе, причем в качестве органического растворителя используют толуол при объемных соотношениях яичного масла и толуола (1,0: 12,0)(1,0: 16,0). В результате использования предлагаемого изобретения выход рестриктазы А1ы1:составляет 10000.15000 ед/г биомассы.. 2 табл, 1449582

Изобретение относится к химической промышленности, касается способа получения .рестриктазы А?и1 из клеток бактерий Arthrobacter luteus.

Цель изобретения — повышение стабильности рестриктазы Alu1 и увелиЧение выхоца целевого продукта.

Способ предусматривает разруше". ние клеток в присутствии б-8%-ного аствора яичного масла в толуоле, в эате сохраняется 9ОХ активности ретриктазы А1и1. При разрушении клеток олько в присутствии толуола в лиэае сохраняется 60% активности рестиктаэы А1и1, т.е. в 1,5 раза меньше, ем при добавлении б-8Х-ного раствора ичного масла в толуоле.

1.

Яичное масло получают иэ желтка уриных яиц . Яичное масло имеет слеующий состав, Х: липиды 60, этилоый спирт 15, вода 25. Липиды включат большую и крайне ..разнородную руппу веществ: лецитин, кефалин, риглицериды, холестерин и др.

Пример 1. 10 г биомассы Аг? ЪгоЬасter luteus ВКПМ . В-3670 .размораживают и суспендируют в 20 мл рабочего буфера (трис-НС1, 0,01?й„ фН 7,2-7,6 2-меркаптоэтанол. 0,01И).

К ЗО мл суспенэии добавляют 5 мл

8%-ного раствора яичного масла в толуоле. Отношение яичного масла к тойуолу 1,0: 12,0. Во время разрушения клеток температуру суспензии поддер швают на уровне 1-2 С. Обрабатывают успензию ультразвуком 5-10 с 2-.3 аза.

Обработанную ультразвуком микробную массу центрифугируют на центрифуГе "High ppeed" (10000 х g, 30 мин).

После центрифугирования отбирают водный слой и наносят на колонку с фосфоцеллюлозой. (V.= 40 см ), уравновешенную рабочим буфером.

Фракции, содержащие рестриктазу ф ui подвергают дальнейшей очистке с помощью колоночной хроматографии на гепарин-сефароэе.

Активные фракции дналиэируют против 1 л диалиэной смеси в течение

12 ч.

Состав диализной смеси: глицерин

50%, трис-НС1 10 мМ, рН 7,4, КС1

50 мИ.

Выход рестриктазы Alui 150000 ед/

/10 мл, активность 15000 ед/мл., выХод 15000 ед/г биомассы.

Для измерения активности рестриктазы Alui используют метод электрофореэа в геле.

За единицу активности рестриктаэы

Alui принимается количество фермента, достаточное для полного расщепления о

1 мкг ДНК фага A эа 1 ч при 37 С..

Пример 2. Суспендирование

10 биомассы проводят аналогично примеру 1. К 30 мл суспензии добавляют

5 0 мл 7%-ного раствора яичного масла в толуоле. Отношение яичного масла к толуолу 1,0: 13,0. Дезинтеграцию

15 клеток и последующее выделение рестриктаэы Alu1 проводят аналогично примеру .1.

Выход рестриктазы Alu1 125000 ед/

/10 мл, активность 12500 ед/ип, вы20 ход 12500 ед/г биомассы. . Пример 3. Суспендирование биомассы проводят аналогично примеру 1, К 30 мл суспензии ;.добавляют

5 О мл ...6%-ного раствора яичного масла в толуоле. Отношение яичного масла к толуолу 1,0: 16,0. Дезинтеграцию клеток и последующее выделение рестриктаэы Alu1 проводят аналогично примеру

Выход рестриктаэы Alu1 100000 ед/

/10 мл, активность 10000 ед/мл, выход 10000 ед/г биомассы.

Пример 4. Сусаендирование. биомассы проводят аналогично примеру 1. К 30 мл суспенэии добавляют

5,0 мл . 5%-ного раствора. яичного масла в толуоле. Отношение яичного масла к толуолу 1 О:19,0. Дезинтеграцию клеток и последующее выделение рестриктазы Alui проводят аналогично примеру 1.

Выход рестриктазы А1u1 50000 ep/

/10 мл„ активность 5000 ед/мл, выход

5000 ед/г биомассы.

II р и м е р S. Суспендирование биомассы проводят аналогично примеру 1. К 30 мл суспензии добавляют

5 мл 9Х-ного раствора яичного масла в толуоле. Отношение яичного масла к толуолу 1,0: 10,0. Дезинтеграцию клеток и последующее выделение рестриктаэы А1п1 проводят аналогично примеру 1, Выход рестриктаэы Alu1 55000 ед/

/10 мл, активность 5500 ед/мл, выход 5500 ед/г биомассы.

Пример 6. 10 г .биомассы Ar"

throbacter luteus BKIlM В-3670 размораживают и суспендируют в 20 мл ра

1449582

i0

20

30

40

50 бочего буфера (трис-НС1,0,0!М, рН

7,2-7,6; 2-меркаптоэтанол 0,01M).

К 30 мл суспензии добавляют 5 мл концентрированного толуола. Во время разрушения клеток температуру суспенэии поддерживают на уровне 1-2 С Обрабатывают суспенэию ультразвуком

5-10 с 2-3 раза.

Обработанную ультразвукЬм микробную массу центвифугируют на центрифуге "High speed" (30000 х я, 30 мин).

После центрифугирования отбирают водный слой и наносят на колонку с фосфоцеллюлоэой (U = 40 см ), уравновешенную рабочим буфером.

Фракции, содержащие рестриктазу

Alu1 подвергают дальнейшей очистке с помощью колоночной хроматографии на гепарин-сефарозе.

Активные фракции диализируют против 1 л диализной смеси в течение

12 ч.

Состав диализной смеси: глицерин

50Х трис-НС1 10 мМ, рН 7,4, КС1

50 мМ.

Выход рестриктазы Alui 100000 ед/

/10 мл, активность 10000 ед/мл, выход 10000 ед/г биомассы.

Пример 7. Суспендирование проводят аналогично примеру 1. К

30 мп суспензии добавляют 4 мп концентрированного толуола. Дезинтеграцию клеток и последующее вьделение рестриктаэы Alui проводят аналогично примеру 1.

Выход рестриктазы Alu1 83000 ед/

/ 10 мл, активность 8300 ед/мл, выход

8300 ед/г биомассы.

Пример 8. Суспендирование биомассы проводят аналогично примеру 1. К 30 мл.суспензии добавляют

3 мл концентрированного толуола. Дезинтеграцию клеток и последующее выделение рестриктазы Alui проводят .аналогично примеру 1.

Выход рестриктазы Alu1 66000 ед/ /10 мп, активность 6600 ед/мл, выход ,6600 ед/г биомассы.

Выход рестриктаэы Alu1 75000 ед/

/ 10 мл, активность 7500 ед/мл, выход

7500 ед/г биомассы.

В примерах 4-8 иллюстрируются запредельные значения параметров.

Данные, полученные в результате вьделения рестриктазы Alu1 из штамма бактерий Arthrobacter luteus ВКПМ

В-3670 с использованием разных способов, представлены в табл. 1.

Пример 10. Для вьделения ре" стриктазы Alui используют биомассу бактерий Arthrobacter luteus ВКПМ

В-1810. Размораживание биомассы, дезинтеграцию клеток и вьделение фермента проводят аналогично примеру I, Выход рестриктаэы А1и! 80000 ед/

/10 мл, активность 8000 ед/мл, выход

800 ед/г биомассы.

Пример 11. Для вьделения ре- . стриктазы А1и! используют биомассу бактерий Arthrobacter luteus ВКПМ

В-1777. Размораживание биомассы, дезинтеграцию клеток и вьделение фермента проводят аналогично примеру 1.

Выход рестриктазы. Alu1 40000 ед/

/10 мл, активность 4000 ед/мл, выход

4000 ед/г биомассы.

Данные, полученные в результате .. вьделения рестриктаэы Alu1 из разных штаммов бактерий Arthrobacter luteus с использованием различных способов, представлены в табл. 2.

Из табл. 2 видно, что при выделении рестриктаэы Alu1 из разных бактериальных штаммов Arthrobacter luteus происходит увеличение активности и выхода фермента по сравнению с известным способом.

Формула изобретения

Способ получения рестриктазы А1и1, включающий разрушение клеток Arthrobacter luteus, фракционирование полу ченного лизата и очистку целевого продукта ионообменной хроматографией и диализом, о т л и чающий с я тем, что, с целью повышения стабильности рестриктазы Alu1 и увеличения выхода целевого продукта, разрушение

Пример 9. Суспендирование биомассы проводят аналогично примеру 1. 30 мл суспензии обрабатывают ультразвуком 5-10 с, 2-3 раза. Последующее выделение рестриктаэы Alui проводят аналогично примеру 1. клеток проводят в присутствии стабилизатора — 6-8Х-ного раствора яичного масла в органическом растворителе, причем в качестве органического раст55 ворителя используют толуол при обьемных соотношениях яичного масла и толуола 1,0: 12,0-1,0: 16,0.

1449582

Таблица 1

Способ получения рестриктазы Alu1

Штаммпродуцент

С использованием толуола и ультразвука

С использованием удьтраэвука

Актив- Выход, ность, ед/г ед/мл биомассы

Выход, ед/г биомассы

Активность, ад/мл

Arthrobac er luteus

ВКПМ В-3670 15000

15000 10000 10000 7500 7500

Таблицa2

Способ получения Alu1, Штамм-продуцент

1 э

С использованием С использованием толуола и ультра- ультразвука звука

Актив- Выход, ность, ед/г био " ед/мл массы

Актив- Выход, ность ед/г био ад/мл массы

Выход, ед/г биомассы ность, ед/мл

7500

7500

4000

4000

2000

2000

Составитель Н,Ходарев

PegaKTop И.Горная ТехредЛ.Сердюкова Корректор О.Кравцова

Заказ 6934/28 Тираж 520 Подписное

ВНЙИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 производственно-полиграфическое предприятие, r . Ужгород, уп. Проектная, 4

Arthrobacter 1uteus BK1IN В-3670

Arlthrobañtår luteus ВКПМ В-1810

Artthrobacter lu"

t sus ВКПМ В-1 7 77

С использованием яичного масла в толуоле и ультразвука

С использованием яичного масла в толуоле и ультразву ка

15000 15000

8000 8000

4000 4000

Актив- Выход, ность, ед/г ед/мл биомассы

10060 10000

5300 5300

2600 2600