Способ получения вакцины для профилактики и лечения инфекции мочевых путей

Способ получения вакцины для профилактики и лечения инфекции мочевых путей

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к области медицинской микробиологии, в частности к получению лечебных вакцин. Сущность способа сводится к тому, что десять уропатогенных штаммов, вьщелеиных от больных,«в число которых входит 6 штаммов Е. coli и по 1-му штамму К1. pneumoniae, Р. mor- ganis, P. mirobilis и S. faecalis, раздельно культивирзтот в жвдкой или на плотной питательной среде, полученные биомассы инактивируют различ- . ньми способами (тепловая обработка, J-облучение или химическая обработка). Затем обработанные биомассы смешивают до конечной концентрации 2- 10 клеток/мл. Смесь бактерий сорбируют на фосфате алюминия при концен-. трации последнего 1,5-10 мг/мл вакцины . Для сохранения свойств вакцины добавляют тиомерсаль и при необходимости лиофилизируют. 9 табл. СО

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН ае (и) 5п 4 А 61 К 39/116

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3946994/28-13 (22) 30. 08. 85 (31) 4181/84 (32) 31. 08. 84 (33) СН (46) 15.01.89. Бюл. I 2 (71) Золько Базель АГ (СН) . (72) Любинко Стойкович (YU), Радмила

Павич (СН) и Вера Спасоевич (YU)

:(53) 615 ° 372(088.8) (56) Аналогов в патентной и научно. технической литературе не обнаружено, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ДЛЯ

ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИИ МОЧЕВЫХ ПУТЕЙ (57) Изобретение относится к области медицинской микробиологии, в частности к получению лечебных вакцин.

Сущность способа сводится к тому, что десять уропатогенных штаммов, выделенных от больных, .в число которых входит 6 штаммов Е. cali и по

1-му штамму Kl, pneurnoniae, P. morganis, Р. ппгоЪ11is u S. 7aecalis, раздельно культивируют в жидкой или на плотной питательной среде, полученные биомассы инактивируют различными способами (тепловая обработка, -облучение или химическая обработка).

Затем обработанные биомассы смешивают до конечной концентрации

2 10 клеток/мл. Смесь бактерий сорби9 руют на фосфате алюминия при концен-. трации последнего 1 5-10 мг/мл вакцины. Для сохранения свойств вакцины добавляют тиомерсаль и при необходимости лиофилизируют. 9 табл.

1452462

Изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к спосо-. бам получения лечебных вакцин, Пример, Сначала от пациентов которые страдали от инфекции идчевых путей, получают пробы мочи (среднеструйная моча) и сразу делают пересев на агар MacConkey. После засевания пластины с агаром инкубируют в тече- 10 о ние 16-18 ч при 37 С, затем выделяют образованные колонии и идентифицируют определением их биохимических и биологических свойств, Индентифицирование Streptococcus

faecalis (энтерококка) с использованием метода окраски по Граму характерных небольших колони1. и следующих испытаний: каталаза (в присутствии 20 подогретой крови) гемолиз рост при 45 С + рост при рН 9, 6

+ рост в 6,5Х-ном растворе 2S

NaCl + р "т на 40Х. желчи + определение полисахарида— антигена Р +

В табл. 1 приведены критерии, при-30 меняемые для идентификации штаммов

Escherichia coli, Proteus u Klebsiella, Идентифицированные таким образом колонии оставляют на пластинах с о агаром в течение 24 ч при 37 С для .альнейшего роста, затем суспендируют в физиологическом растворе хлористого натрия, испытывают на чистоту при ! помощи метода окраски по Граму и за- ® мораживают в сухом виде.

Полученные отдельные штаммы

Escherichia coli характеризуются признаками, приведенными в табл. 2.

В табл. 3 приведены биохимические свойства штаммов Escherichia coli.. В табл. 4 представлены признаки, характеризующие штаммы Proteus u

Klebsiella.

Биохимические свойства штаммов

Proteus u Klebsiella представлены в

50 табл. 5.

В табл. 6 представлены признаки, характеризующие штамм Streptococcus

f aecal is.

Биохимические свойства штамма

Streptococcus faecalis приведены в табл. 7.

Морфологические свойства выделенных штаммов можно обобщить следующим образом.

Escherichia "coli грамотрицательные палочки, 1,1-1,5 2,0-6,0 Им (живая форма), подвюкны благодаря жгутикам.

Proteus mirabilis u Proteus morganix: грамотрицательные палочки, 0,4-0,6<0,1-3,0рм без оболочки, подвижны, со жгутиками (не все).

Klebsie la pneumoniae: грамотрицательные, неподвижные палочки, 0,31„5 0,6-6,0 р м.

Streptococcus faecalis! грамотрицательные шарообразные кокки, 0,51, О шм, неподвижные.

Нтаммы Escherichia col i исследуют затем на их серологические свойства, и для этой цели сначала на предметном стекле проводят тест на склеивание с многовалентными ОК-сыворотками А, В, С, D, Е. Данные приведены в табл. 8.

Указанные 10 штаммов депонированы в Центральном Бюро плесневых культур (Нидерланды) под названиями CBS 516.34 до CBS 525,84 и переведены в немецкую коллекцию мик1оорганиэиов (ФРГ) под входящими номерами РЯМ 3229-DSM

3238.

Для получения вакцины штаммы отдельно культивируют на твердой или жидкой питательной спеде; предпочтительно применяют твердую питательную среду, например питательный агар, который имеет следующий состав, г/л:

Мясной экстракт (Difco Beef Extract) 3

Бакто-пептон 5

Хлористый натрий 5

Бакто-агар 15

Среду стерилиэуют в течение о

15 мин при 121 С, она имеет рН около

7,2.

Для промышленного получения применяют Коих-баллоны, для получения в лаборатории применяют чашки Петри.

Инокуляцию осуществляют при помощи посевного материала, несколько миллиметров которого равномерно распределяют по всей поверхности. Коих-баллоны закрывают бумажной пробкой и среду хранят на складе инокулированной поверхностью вниз. Инокулированные культуры инкубируют в течение

24 ч при 37 С.

14524

Поверхность разрастания колонии бактерий смывают необходимым количеством (в зависимости от плотности роста культуры в сосуде) буферного раствора фосфата — раствора хлористого натрия (РВБ) при легком раскачивании, не нарушая поверхности агара °

Из каждого баллона или иэ каждой 10 чашки Петри берут мазок, окрашивают по методу Грама и проверяют на чистоту. Баллоны или чашки Петри, которые окажутся загрязненными, выбрасывают. Суспенэии, которые происходят 15 от одного штамма или от сбора, смешивают с помощью стерильного сита из нейлоновой ткани.

Инактивирование, как и само культивирование, для каждого штамма про- 20 водят отдельно, Его можно осуществлять нагреванием при температуре около 55-60 С в течение приблизительно I ч, обработкой раствором формальдегида или облучением !! -лучами,>5

Полученные биомассы соединяют, инактивируют на водяной бане при ,о

6" С в течение 1 ч и после теплового инактивирования добавляют фенол (предельная концентрация 0,357), 30

Пробу суспензии берут для опыта на стерильность и для испытания на идентичность и концентрированное запасное количество хранят в холодильном шкафу. 35

Если опыты на стерильность через

1 ,3 дня не показали никаких загрязнений, процесс получения ведут дальше. За опытом на стерильность наблюдают в течение 14 дней и если .проба на стерильность показывает рост каких-нибудь организмов, этот сбор устраняют.

Содержимые сборников (инактивированные суспензии, которые происходят от одного щтамма) центрифугируют при 3000 об/мин в течение 1 ч в охлажденной центрифуге (Sorval 4 CR центробежный ротор 2000), супернатант удаляют, и осадок бактерий суспендируют в растворе хлористого натрия, который содержит 0,017 тиомерсаля.

Суспензию хранят при 4 С (+2 С).

Концентрированные суспензии

10 штаммов Е. coli, Proteus mirabilis, Proteus morganis Klebsiella

pneumoniae, Streptococcus faecalis смешивают таким образом, что в 1 мл содержится E. coli 6 штаммов, каждо62

ro 2,5 1О, всего 1,5 10 микробо

Proteus mirabilis 1 штамм, 7,5 10 микробов; proteus шог ап1 l штамм, 7,5 10 микробов; Klebsiella pneumoniae 1 штамм, 3 10 микробов;

Streptococcus faecalis 1 штамм, 5.10 микробов, Вместе — 2.10 микро9 бов/мл.

Так как добавляют алюминийфосфатный гель, концентрация соответственно должна быть выше. Алюминийфосфатный гель получают следующим образом.

854. г калийалюминийсульфата < к!2 Н, О растворяют в бл воды и фильтруют, Затем растворяют 685 r тринатрийфосфата 12 Н О в 6 л воды.

Раствор алюминия выдерживают при о„

37 С. Оба раствора одновременно выливают в 2! л воды. Осадок центрифугируют, повторно суспендируют в 13 л воды и суспензию .снова центрифугируют.

Далее осадок повторно суспендируют, доводят до общего объема 8,1 литра, устанавливают при помощи

5 н, NaOH величину рН 6,0 и выдерживают в автоклаве в течение l ч при о

121 С. Этого количества достаточно, чтобы получить 66 л вакцины с 3 мг

А!РО4 /мл или 0,66 мг Аl/мл.

Адсорбированную вакцину после проверки величины рН, которая должна составлять 6,2-7,0, разливают в стерильные не содержащие пирогена ампулы емкостью 1 мл в количестве 0 5 мл на дозу. Вакцину во время разливания взбалтывают.

Общее число инактивированных микроорганизмов в одной дозе, т.е.

0,5 мл, составляет около 1 ° 10

Наконец, вакцину испытывают: на стерильность по Европейской фармакопее; на токсичность по предписаниям

Всемирной организации эдравоохранения (прирост веса у мыши)); на ненормальную токсичность но

Европейской фармакопее.

Вакцина может быть получена в лиофилизированной форме.

Концентрированную инактивированную суспензию, полученную аналогично описанному, разбавляют таким образом, чтобы она в 0 5 мл содержала около

1 lO инактивированных бактерий укаэанного состава. Для разбавления применяют 1Х-ный раствор гуманальбумина

5 145 или заменителя плазмы с 0,017 тиомерсаля в 0,85 н. растворе 11аС1.

Флакончики объемом 2 мл наполняют при стерильных условиях 0,5.мл описанной разбавленной суспензии зао мораживают приблизительно при -45 С, после этого сушат в вакууме в лиофилиэационном аппарате. Температура о сушки не должна превышать +36 С. Весь процесс лиофилизации продолжается

24 ч. После лиофилиэации флакончики ! закрывают резиновыми пробками в атмо1 сфере азота и алюминиевыми колпач1 хами.

Для введения алюми! ..йфосфата, од-! новременно используемого в качестве растворителя для повторного растворения, перед наэн::.чением применяют водный алюминийфс,сфатный гель с концентрацией A1РО 2 мг/мл. Алюминий) фосфатный гель, прежде чем его разливают в ампулы, разбавляют раствором хлористого натрия до такой степени (около 12 раз), чтобы конечная концентрация была 2 мг/мл.

Разливаемое количество в ампулы емкостью 1 мл составляет 0 5 мл.! Для испытания вакцины на стой2462 б штаммов бактерий сусгендируют с 9 мл питательной среды и инкубируют кульа туру при 37 С в течение 24 ч. Вторую вспомогательную культуру применяют для приготовления антигенов.

600 мл питательной среды инокулируют при помощи посевной культуры (каждый штамм отдельно). Культуры о инкубируют при 37 С в течение 36 ч.

После этого добавляют формалин до конечной концентрации 0,17.. Культуры

О инкубируют при 37 С в течение 7 дней.

Каждую культуру испытывают после !

5 этого на отсутствие живых бактерий и на стерильность. Инактивированную суспензию бактерий центрифугируют в охлаждающей центрифуге в течение

1 ч при 3000 об/мин. Осадок повторно

20 суспендируют в буферном растворе фосфата — растворе хлористого натрия (pH 7,2) — так, чтобы достигнуть концентрации около 20 10 бактерий/мл. Для пробы на агглютинацию

25 применяют около 2 10 .бактерий/мл в качестве агглютиногена.

Опыт на агглютинацию.

Сыворотки мышей в 1:2-стадиях разбавления разводят буферным раство30 кость при хранении дважды определяют ее способность к образованию антител у мыши.

Иммунизация мышей.

1пести группам по 10 мышей каждая (мужского пола, NNRl-штамм, вес !620 г) проводят иммунизацию интраперитонеальным введением вакцины. Две дозы (0,5 мл вакцины) впрыскивают с интервалом в две недели. 20 мышам из того же выращивания и с таким же весом, которые служат в качестве контрольной группы, впрыскивают только алюминийфосфатный гель (0,5 мл).

Через дне недели после второй инъек-. ции берут стерильно кровь и объединяют по группам. После свертывания получают сыворотку от каждого объединения центрифугированием и хранят при глубоком замораживании при о

-22 С до серологического испытания.

Приготовление антигенов (агглютиногенов).

Девять гомологических штаммов бактерий, которые содержатся в вакцине, применяют для получения антигенов; штамм Ес 654 нельзя было агглютинировать (К-форма) и его нельзя применять в качестве агглютиногена. Лиофилизированные культуры

55 ром фосфата — физиологическим раствором хлористого натрия с рН 7,2.

По прошествии 18 ч при 37 С и остальных 24 ч при 4 С снимают показания реакции. В качестве титра соответствующей сыворотки принимают максимальное разбавление, при котором еще можно было установить видимую агглютинацию бактерий.

Для агглютининовых титров сыворо ток мышей были. найдены геометрические средние значения, приведенные в табл. 9.

Иэ этих результатов следует что о вакцина при хранении при 4 С сохраняет свою полную эффективность по меньшей мере в течение двух лет.

Показаниями вакцины являются особенно цистит, простатит, цистопиелит и пиелонефрит.

Пациенты, которые не имеют острого лихорадочного состояния (противопоказание), получают с интервалами от 1 до 2 месяцев всего 3 внутримышечные инъекции по 0,5 мл вакцины.

При появлении сильных реакций на вакцину лечение следует прекратить.

Через год после этого следует провести ревакцинацию в той же дозе.

7 14524

Ф о р м у л а изобретения

Способ получения вакцины для профилактики и лечения инфекции мочевых путей, заключающийся в том, что используют десять уропатогенных штаммов бактерий, из которых шесть штаммов

Escherichia coli Ec 455 UB, Ес 525 UB, Ес 560 UB, Ес 616 UB, Ес 654 UB u

Ес 719 UB и по одному штамму Klebsiella pneumoniae 168, Proteus mirabilis 63B, Proteus morganis 58B и

Таблица 1

Е. cali Proteus Protemorganis из mirabilis

Klebsiella

Критерии

pneumoniae

Подвижность

Рост в KCN-среде

Газообразный углевод глюкозы

Кислота лактозы

+ (d) сахароэы мальтоэы маннита

+ (d) треалозы

+ (d) ксилозы

Мелатиновый гидролиз

Индол

Уреаэа

Цитрат как С-источник

Н Б TS1 (тройной агар сахаражелеза) Лиэиндегидрокарбоксилаза

62 8

Streptococcus йаеса1is 676, при этом все штаммы выращивают раздельно, инактивируют тепловой обработкой при о

55-60 С, или формальдегидом, или гамма-облучением, затем культуры смешивают, при этом конечная концентрация всех бактерий в вакцине составляет 2 10 клеток/мл, полученную

9 смесь бактерий сорбируют на фосфате алюминия и ри концентрации его 1, 510 мг/мл вакцины и затем в целевой продукт добавляют тномерсаль.

Таблица 2

1452462

Ферментация углеводов

Штамм Escherichia coli

Углевод (DSM от 3229 до 3234) Лактоза +

Сахароза 0

Маннит

Мальтоза +

Мелибиоэа +

Рафиноза 0

0

Рамноза

Треалоза +

Салицин 0

0

Рибоза

Амигдалин 0

Галах то за +

Адонит (рибит) 0

0

0

Инозит

0

0

П р и м е ч а н и е: "+" — кислота.

Сорбит

Арабиноза

Глюкоза

Манноза

Фруктоза

Дульцит

Целлобиоза

Кс ило за

455 UB 525 UB 560 UB 616 UB 654 UB 719 UB

1452462

Таблица 3

Опыт

455 UB 525 UB 560 UB 616 UB 654 UB 719 UB

О 0

0 0

0 О

Мочев ина

Гемолиэ на пластинах крови с агаром

О

Желатиновый гидролиэ

0

О

Н S ъ

Подвижность

П р и м е ч а н и е: "+" - положительная за 24 ч, "0" — отрицательная после 72 ч.

Таблица 4

Ферментация углеводов

Углевод

Лакто за

О

Мальтоэа

Мелибиоза

Рафино за

Рамноэа

Треалоэа

Салицин

Рибоза

Амигдалин

Цитрат

Индол

Сахароза

Манн ит

Klebsiella Proteus

pneumoniae mirabilis

К1 16В 63В (DSM 3235) (DSM 3238) Proteus

morganis

58В (DSM 3237) 4 2462

Галактоза

Глюкоза

Манноза

Фруктоза

Адонит (рибит) 0

Инозит

Дул ьцит

Целлобиоза

Ксилоза

П р и м е ч а н и е : "+" — кислота, Таблица 5

Мочевина О

0 ром

Цитрат

Индол 0

Сорбит

Арабиноза

Гемолиз на пластинах крови с araЖелатиновый гидролиз 0

Продолжение табл.4

15 з 4

Подв ижность 0 + +

П р им е ч а н не: "+" — положительная эа 24 ч, "0" -отрицательная после

72 ч, Таблица 6

Ферментация углеводов

Лактоза

Сахароза

Амигдалин

Галактоэа

Сорб ит

Арабино за

Глюкоза

Манноза

Фруктоэа

Адонит (рибит) 0

Инозит

Дульцит

Маннит

Мальтоэа

МелибиоРафино за

Рамноза

Треалоза

Салицин

Рибоза

1452462

Продолжение табл.5

1452462

l8

Продолжение табл.б

Целлоб иоза

Ксилоэа

П р им е ч а н и е: "+" — кислота.

Таблица 7

Streptococcus faecalis 676

Опыт

Мочевина

Тип гемолиза

Негемолитический

Желатиновый

0 гидролиз

Восстановление лакмусового молока

Индол

Эскулин +

Рост на питательной среде

40Х желчи

6,57 хлористого натрия рН 9,6

Теплостойкость

60 С в течение

30 мин

Пр имеч ан ие:"+" положительный; отрицательный, Таблица 8

"О"

Штамм Обозначение Серологический тип

Escherichia coli

Гемолитический, тип не определен

Escherichia coli

Escherichia cali

Escherichia coli

Escherichia cali

Escherichia coli

Ес 455 UB

Ес 525 UB

Ес 560 UB

Ес 616 UB

Ес 654 UB

Ес 719 UB

0,6: К13: Н!

0 1: Kl: Hj

0,4 : 63 : Н5

0,75 : — : Н5

R — форма

Титр (обратные величины) Антиген

Испытание Испытание

1981 1983

Е.coli

455 UB 101595 90591

Е. coli

525 UB 905,1

)015,5

Е. coli

560 UB .1015,5 905,1

Е. coli

616 UB

905,1 806,3

Е. coli

719 UB

1280

1280

Kl ebs ie l 1 a

pneumoniae

16 В 201,6

201,6

160,0 142,5

113,1

I13,I

71,3

71,3

Составитель А. Маныкин

Редактор А. Огар Техред g.яндык Корректор М. Самборская

Тираж 644,Заказ 7093/57

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Proteus

mirabilis

63 В

Proteus шогяап3.9

58 В

Streptococcus

faecalis

676

1452462

Таблица 9