Штамм гибридных культивируемых клеток животных rаттus norvegicus, используемый для получения моноклональных антител к гликопротеиду базальных мембран энтактину

Штамм гибридных культивируемых клеток животных rаттus norvegicus, используемый для получения моноклональных антител к гликопротеиду базальных мембран энтактину

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение.относится к биотехнологии и может быть использовано для диагностики и исследования патологических состояний. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Rattus norvegicus, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к гликопротеиду базальных мембран энтакти ну . Штамм получают гибрид из ацией спленоцитов крысы, иммунизированных препаратом ламинина из мьш1иной опухоли , с клетками мьпииной миеломы X 8.653. Продукция МКА на 5-й день культивирования составляет 10- 20 мкг/мл. МКА относятся к классу Ig G у 2 а(Н)., Они специфически взаимодействуют с гликопротеидом базальных мембран ламинином м.м. 150 kD. Штамм культивируют на среде Игла в модификации Дульбекко с 20% эмбриональной телячьей сыворотки, модальное число хромосом в клетках штамма 86. I (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„,SU„» 1458385 А1 (51) 4 С 12 N 5/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

2 шинно в полном адьюванте Фрейнда, через 1 месяц — две внутрибрншинных инъекции в неполном адьюванте Фрейнда с интервалом 10 дней между инъекция-. ми, через 10 дней - внутривенная инъекция без адьюванта (в переднюю камеру глаза). Объем раствора антигена 0,15 мл, адьювант добавляют в равном объеме. Гибридизацию проводят на

4 день после 4-й иммунизации. Для этого клетки селезенки иммунных крыс (10 ) гибридизуют с 5 10 7 клеток мышиной миеломы Х63-Ag 8.653 с помощью

50%-ного раствора полиэтнленгликоля с мол. мас. 1500. Культивирование гибридных клеток ведут в 96-луночных платах на предварительно посаженных пернтонеальных макрофагах мыши (5-8

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ

IlO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4258891/28-13 (22) 09.06 ° 87

:(46) 15.02.89. Бюл. М 6 (71) Всесоюзный онкологический научный центр АМН СССР (72) А.B. Любимов, Л.В. Литвинова, В.М, Сенин и А.В. Афанасьева (53).578.085.23(088.8) (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ RATTUS NORVEGICUS,,ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛО НАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ГЛИКОПРОТЕИДУ БАЗАЛЬНЫХ МЕМБРАН ЭНТАКТИНУ (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для диагностики и исследования патологических состояний. Целью изобретения является получение штамма гибИзобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для диагностики и исследования патологических состояний.

Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Rattus norvegicus, продуцирунщего моноклональные антитела (МКА) к гликопротеиду базальных мембран энтактину.

Штамм получают следующим образом, В качестве антигена используют частично очищенный препарат ламинина из мышиной опухоли EHS в котором энтактин присутствует в виде примеси.

Схема иммунизации: крысы линии Фишер получают 4 инъекции по 150 мкг белка каждая. Первая инъекция — внутрибрю ридных культивируемых клеток ..животных Rattus norvegicus, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к гликопротеиду базальных мембран энтакти1ну. Штамм получают гибридизацией спленоцитов крысы, иммунизированных препаратом ламинина из мышиной опухоли, с клетками мышиной миеломы

Х 63=Ag 8.653. Продукция МКА на 5-й день культивирования составляет 1020 мкг/мл. МКА относятся к классу

Ig G у 2 а(Н)., Они специфически взаимодействуют с гликопротеидом базальных мембран ламинином м.м. 150 kD.

Штамм культивируют на среде Игла в модификации Дульбекко с 207. эмбриональной телячьей сыворотки, модальное число хромосом в клетках штамма 86.

1458385

50! з

1О клеток на лунку). Питательная среда: среда Игла в модификации Дуль бекко (Д1ЕМ) с 207 эмбриональной телячьей сыворотки или 101 эмбрио-, нальной телячьей сыворотки и 107 лошадиной сыворотки, II мМ пирувата, 10 4 М гипоксантина, 4 «10 M аминоптерина и 1,6 10 М тимидина, 100 ед/мл гентамицина. Гибридомы клонируют 10

2 раза, высевая на лунку .с.макрофага-. ми по 1 клетке. Отбор клонов осуще, ствляют иммунофлуоресцентным окрашиванием криостатных срезов почки мыши.

Из 500 проверенных клонов культураль- 15 ! ная жидкость (КЖ) одного из них реагирует в иммунофлуоресценции с базальными мембранами почки, причем особен. но сильно с базальными мембранами, клубочковых капилляров. В радиоимму- 20 нопреципитационном тесте с лизатом мышиной тератобластомы ТБ 24 КЖ этого клона реагирует с сульфатированным гликопротеидом энтактином (мол. мас.

150 кД). Данный клон выводят в массо- 25 вую культуру и обозначают ЭАМ. Штамм хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Всесоюзной коллекции клеточных культур (Институт цитоло- З0 гии АН СССР) под номером BCKK (П)

124 D.

Штамм характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки.

Среда культивирования — среда

Игла в модификации Дульбекко (ДМЕМ) с )OX эмбриональной телячьей сыворот" ки (или 107 эмбриональной телячьей сыворотки и 1О лошадиной сыворотки), 40

1 мМ глутамина, 100 ед. гентамицина о в 1 мл. Клетки выращивают при 37 С и 5i. углекислоты в атмосфере. Для выращивания штамма можно использовать стеклянную или пластиковую по- 45 суду. Во флакон объемом 25 см в 5 мл среды засевают 2-5 10 клеток 3АМ.

Пассаж — 1 раз в 4-5 дней той же дозой клеток..Без подсчета клеток—

1:3. Культивирование in viva. Так как гибридома получена при слиянии клеток крысы и мьппи, культивирование in vivo в обычных животных невозможно, Кариологические признаки.

Модальное число хромосом — 86 (в 50Х метафаз двойные микрохромосомы).

Продуктивность штамма.

Секреция NKA на 5-й день культивирования составляет 10-20 мкг/мл культуральной жидкости. Стабильная секреция продукта сохраняется до 35 пассажей в культуре. При регулярном тестировании не отмечено снижения выработки антител.

Характеристика пол:еэного продукта

MKA относятся к классу 1 g Gp2a(H), Они специфически взаимодействуют с гликопротеидом базальных мембран эн" тактином. Метод оценки сохранения специфичности: непрямая иммунофлуоресценция (окрашиваются базальные мембраны на срезах) и радиоиммунопреципитация: антитела связывают с сефарозой с пришитыми иммуноглобулинами кролика против иммуноглобулинов крысы, инкубируют с меченным аминокислотами или I лизатом мьппиной

113 тератобластомы ТБ-24 или мышиной опухоли EHS преципитат подвергают электрофорезу в градиентном полиак" риламидном геле (5-15/) в присутствии додецилсульфата натрия и высушенный гель подвергают авторадиографии. Положительная реакция проявляется присутствием на автографах меченой полосы 150 КД.

Контаминация. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды.

Криоконсервирование. Клетки штамма ресуспендируют в эмбриональной телячьей сыворотке, содержащей IOX диметилсульфоксида, в концентрации

1-,3 10 клеток в 1 мл, разливают в а стерильные пластиковые ампулы при

4 С и замораживают.в жидком азоте по программе со снижением температуры на 1 С в минуту с последующим переносом в жидкий азот. Размораживание: 1 мин. при 37 С. Клетки разво" дят в 5-10 мл полной среды, центрифугируют при комнатной температуре

5 мин при 1000 об/мин„ сливают среду, заливают 1 мл свежей среды и переносят в лунку 24-луночной платы с предварительно посаженными перитонеальными макрофагами мьнпи (25-40

«1О клеток на лунку). Жизнеспособность клеток по включению трипанового синего составляет 50-903.

II р и м е р 1. Кусочки почки, полученной от свежезабитой мыши, помещают в 71-ный раствор желатина в забуференном физрастворе (ЗФР) и неФормула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток aoxm>x Rattus norvegicus

ВСКК (П) Р 124D, используемый для получения моноклональных антител к гликопротеиду базальных мембран энтак-т тину.

Составитель М. Серова

Редактор А. Лежнина Техред N,Äèäöê Корректор М. Демчик

Заказ 326/29 Тираж 500 11одписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. У город, ул. Проектная, 4

5 14583 медленно замораживают в жидком азоте.

Блоки хранят при -70 С. Срезы толщиной 5 мкм готовят на криотоме, фиксируют 5 мин в 10Х-ном формалине и тща5 тельно отмывают в ЭФР. Далее ставят реакцию непрямой иммунофлуоресценции при комнатной температуре. Первая инкубация (I ч) — КЖ клеток штамма.

ЭАМ. После отмывки в ЗФР— вторая ин- 1р кубация (1 ч) — кроличья антисыворотка,к иммуноглобулинам крысы, меченная флуоресцеиниэотиоцианатом. в разведении 1:20 после предварительного истощения сыворотки печеночным порошком 15 мыши. Отмытые в ЗФР сфеэы заключают .в глицерин на ЗФР (1:1). Контроль— первая инкубация с ЗФР вместо МКА, Препарат исследуют в микроскопе 20 с флуоресцентной приставкой. Отмечают свечение баэальных мембран почки.

Особенно .ярко окрашены базальные мембраны клубочковых капилляров. Клетки канальцев, зндотелий сосудов, строма не окрашены, следовательно, не содержат энтактина. Таким образом, полученные МКА специфически выявляют гликопротеид базальных мембран энтак=

85 6 тин и не взаимодействуют с другими белками клетки.

Пример 2. Отмытые,в ЗФР эмбриоидные тельца тератобластомы ТБ-24 заливают в желатин и сразу же замораживают в жидкоя азоте. Далее материал обрабатывают, как описано в примере

1, и исследуют в микроскопе с флуоресцентной приставкой, Отмечают положительную реакцию с матриксом внутри эмбриоидного тельца ТБ-24. Окраска фибриллярная, Скопления клеток в матриксе не окрашены, следовательно, не содержат внутриклеточного энтактина.

Таким образом, полученные МКА дают возможность детально исследовать изменение базальных мембран в экспериментальных опухолях животных в про .цессе инваэии и метастаэирования.