Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus, используемый для получения моноклональных антител к группоспецифическому антигену a эритроцитов человека

Патент 1459238

Авторы

Классы МПК

C12N5/18 - муриновые клетки, например клетки мышей

Реферат

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в гематологии и трансфузиологии. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к группоспецифическому антигену А эритроцитов человека, надежно выявляющие слабые разновидности А₂-А₃антигена А. Штамм получают путем слияния под воздействием полиэтиленгликоля мол.м. 1500 мышиной миеломы РЗ-Х63-Аg8.653 с клетками селезенки мышей линии Babl/с, иммунизированных эритроцитами человека группы А(II) и дальнейшем культивировании в селективной среде ГАТ. При слиянии используют соотношение миеломных клеток и иммунных лимфоцитов 1:2 при общем количестве спленоцитов 120 10⁶ и клеток миеломы 60 10⁶. Эффективность гибридизации 94%. Штамм получают после 5-кратного клонирования методом лимитирующего разведения при 100% антителообразующих клонов в трех последних клонированиях. Полученный штамм обозначают А-86/44, он хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК (II) 87Д и характеризуется следующими признаками. Культуральные признаки. Стационарная суспензионная клеточная культура в жидкой среде, содержащая 300-40010³ кл/мл. Рассаживание 1:2-1:3 через 2-3 сут при снятии клеток резиновым "полисменом". Клонирование осуществляют на перитонеальных мышиных макрофагах. Среда для культивирования R РМI-1640 или ДМЕМ с 20% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 4 мМ L-глютамина, 1% пирувата натрия, 1-2% Нерes-буфера, 510^-5 М 2-меркаптоэтанола, 50 ед./мл пенициллина, 25 мкг/мл стрептомицина. Клетки культивируют при 37^оС, 95% влажности, 6% СО₂ в воздухе. Культивирование в организме животного: мышам линии Ваbl/с за 7-30 сут до введения гибридных клеток вводят пристан в количестве 0,5 мл. Гибридные клетки вводят в количестве 3-6 10⁶ кл/мышь. Среднее время роста гибридомы в асцитной форме 162,5 сут. Морфологические признаки. Штамм представлен слабо прикрепляющимися к субстрату клетками с обычной для гибридных антителообразующих клеток морфологией. Кариологические признаки. Кариотип соответствует виду Mus musculus. Модальное число хромосом 86. Одна метацентрическая и одна субметацентрическая маркерные хромосомы. Продуктивность штамма. Титр антител в культуральной жидкости в реакции солевой агглютинации в круглодонных микроплатах 1:256-1:1024, титр антител в асцитной жидкости 1: 25610³-1: 2 10⁶. Стабильность антителопродукции сохраняется в течение 31 пассажа в культуре. Характеристика полезного продукта. МКА относятся к классу IgМ. Они специфически связываются с группоспецифическим антигеном А эритроцитов человека, при этом выявляют слабые разновидности А₂-А₃ антигена А. Данные МКА активны не только в реакции агглютинации, но и в реакции преципитации в агаре с антигеном А эритроцитов человека. Контаминация. Контаминация бактериями, грибами, микоплазмой не выявлена. Вирусы не тестированы. Криоконсервирование. Клетки замораживают в ростовой среде с 10% ДМСО и 40% ЭТС. Режим замораживания: 1^оС/мин до 40^оС, 10^оС/мин до -120^оС, далее клетки переносят в жидкий азот. Жиэнеспособность после размораживания по трипановому синему 70-72% . После размораживания культивирование ведут в 24-луночных платах по 0,510⁶ жизнеспособных клеток/ячейку на фидере из перитонеальных макрофагов (210⁵клеток/ячейку). Использование штамма иллюстрируется следующим примером. Образцы индуцированной клетками штамма А-86/44 культуральной и асцитной жидкости мышей исследуют по общепринятым методам со стандартными эритроцитами в солевой среде в 96-луночных платах (титр антител) и в реакции агглютинации на плоскости (авидность антител). Под авидностью антител подразумевают сродство изучаемых антител к стандартным эритроцитам человека, оцениваемое по времени появления первых агглютинатов (первый параметр), времени наступления четкой реакции агглютинации (второй параметр) и времени появления крупных агглютинатов (третий параметр). Результаты исследований приведены в табл. 1 и 2. Результаты, приведенные в табл. 1, показывают, что моноклональные антитела асцитной жидкости, секретируемые штаммами А-85/1 и А-86/44, разведенные 1:100, специфически реагируют с эритроцитами групп А(II) и АВ(IV) и не реагируют с эритроцитами групп О(I) и В(III). При этом титр и авидность моноклональных антител, секретируемых клетками штамма А-86/44, выше титра и авидности моноклональных антител, секретируемых клетками штамма А-85/1 по отношению к одним и тем же эритроцитам групп А(II) и AB(IV). Результаты, приведенные в табл. 2 показывают, что МКА, секретируемые штаммом А-86/44, лучше и надежнее выявляют слабовыраженный антиген А в эритроцитах групп А(II) и АВ(IV), чем МКА, секретируемые штаммом А-85/1. Кроме того, полученные МКА выявляют слабовыраженный антиген А во всех образцах эритроцитов, с которыми антитела штамма (А-85/1) вообще не дают агглютинации (образцы эритроцитов 2, 3, 4, 5 группы А(II) и образец 1 группы АВ(IV). Таким образом, штамм гибридных клеток А-86/44 секретирует МКА против группоспецифического антигена А эритроцитов человека, более высокого титра и авидности, чем известные. Продуцируемые штаммом А-86/44 в асцитную жидкость МКА в разведении 1:100 надежно выявляют как сильные, так и слабые разновидности антигена А в эритроцитах человека групп крови А(II) и АВ(IV).

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВСКК (П) 87Д, используемый для получения моноклональных антител к группоспецифическому антигену А эритроцитов человека.

РИСУНКИ

Рисунок 1

MM4A - Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 21.05.2001

Извещение опубликовано: 10.07.2008 БИ: 19/2008