Гексапептид, обладающий противоязвенным действием

Гексапептид, обладающий противоязвенным действием

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Гексапептмд формулы Tyr-D-A a-G y- Phe-Leu-Gfu-OH, обладающий противоязвенным действием.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) () ) ) 14669 А 1

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И QYKPbiT(ìßÌ

ПРИ ГКНТ СССР

G Ê ABYE ЭБРЕТ ""Я i

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4262648/04 (22) 19.06.87 (46) 15.10.91. Бюл, N 38 (71) Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР (72) В.А,Виноградов, М.И.Титов, В.М,Полонский, Н,В.Коробов, А.С."îê,îëîâ,,М,Л,Якушева, Ж,Д,Беспалова, M.В,Овчинников и

БЛ.Г!екалис (531 547 964 4 07 :08п 8) (56) "iau.:ковск -:-« A. г".. Лекар твенные соедства, М.: Медицина, 1984, т. i. с. 317, т, ii, с.

294.

Зowerv iile . К, iN. и др. "Newer апбэесгееог ас;епи for рербс uicers".

Qt ug 1О83 1. 2, .". 2 315 30

Изобретенле относится к новому биологически активному соединению гексапептиду фоомулы i Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-(Ь-ОН, обладающему протлвоязвенным действием, которое может найти применение в медицине.

Цель изобретения — поиск новых соединений пептидной природы, обладающих бо лее высокой противоязвенчой активностью при пероральном применении и низкой токсичностью, Пример 1. Ди-трет-бутиловый эфир карбобензоксилейцил глутаминовой кислоты (i).

6,83 r (17,41 мМ) ди-трет-бутилового эфира карбобензоксиглутаминовой кислоты растворяют в 35 мл метанола и гидрируют в присутствии паллэдиевого катализатора в течение 4 ч, Катализатор Отфильтровывают, промывают на фильтре метанолом, фильт(s))s С 07 К 7!06IIA 61 К 37/02 (54) ГЕКСАПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ ПРОТИВОЯЗВЕННЫМ ДЕЙСТВИЕМ (57) Гексапептид формулы Туг-9-А1а-6!vPhe-Leu-Яiu-ОН, обладающий противоязвенным действием, рат упаривают, растворяют в 25 мл диметилформамида (ЦМФА), К раствору дооавляют

4,50 г (17,41 мМ) и-нитрофенилового эфи;а карбобензоксилейцина. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение суток. Растворитель упаривают, остаток растворяют в 10 мл смеси этилацетатггексан (2:1) и наносят на хроматографическую колонку Lobar С (440-37)

LiChropreo Si 60(63 — 125 мм) — "Merck" (ФР ;, Хроматографию производят в изократичес ком режиме (эл юзнт — атил ацетат: ге ксан

2:1). Фракции, содержащие целевой продукт, собирают, упаривают, сушат в вакуумэксикаторе. Получают 6,02 -(68 ;) продукта.

Бесцветное масло (а)О = -24,2 (С1, ДМФА), Rf: 0,22 (этилацетат;н-гексан 1:2 (А)), 0,61 (толуол:ацетон:метанол;уксусная кислота 14:1:4:1 (Б)), 0,50 (толуол:н-гептан:метилзтилкетон 5;3:1 (В)).

1460965

Ди-трет-бутиловый эфир карбобензоксифенилаланил-лейцилглутаминовой кислоты (!!).

1,56 г (3,09 мМ) (I) растворяют в 10 мл метанола и гидрируют в присутствии паппа- 5 диевого катализатора в течение 3 ч. Катализатор ОтфилътрОВЫВдют, промыВают ня фильтре метанолом и фильтрат упаривают.

Остаток растворяют в 5 мл ДМФА, добавляют 1,30 r (3,09 мМ) и-нитрофенилового 10 эфира карбобензоксифенипаланина, Реакционную смесь перемешивают при комнатной темг7ературе в течение суток. Растворитель упарлвают, остаток растворяют в

30 мл этипацетата. Этилацетат промывают 15

2 g>-ной серной кислотой (20 млх2) и водой (20 млх 2), упаривают, добавляют 25 мл изопропилового спирта и упаривают, Остаток растворяют ffI диизопропиловом эфире, выпавшие кристаллы Отфильтровывают, про- 20 мывают ня фильтре диизопропиловым эфиром и сушат в Вакуум-эксикаторе. Получают 1,55 г (85;, ) продукта с Т,Г7Л. 120 С, 1, 20 = -2(6о (С1,1М. „А), 0„23 (A) (Б), 0,29 (В). 25

Ка рбобе нзо кси-Д-ала нил-гл ицил (И).

0,50: (7,68 МЛ) гпицина растворяют р

7,68 мл 1 н. раствора едкого нзтря и добавляют раствор 2,74 г (7,78 мМ) fl-нитрсфениn0Bof 0 эфира карбобензокси-Д-Яланинз B 30

20 мл ДМФА, Реакционную смесь перемеШИВЯ7О f ПРИ f<О<ИНЯ f Н, .,,1 ГЕМП в"ЗЯТУРЕ В Т цдние суток. Раствор упзривзют, остаток растворя7от в воде, экстрагируют зфирсм (50 ж77<3), водный слой ",:ñäêèñëffþT 2 н, сер- 35 ной кислотой до pH = 2 и эксграгируют этилацет Ятом (50 мл х 3). Зтилацетят промыВЯ7от водой (30 мл х 2), добавляют 50 мл изопропилового спирта и упаривают. Остаток заливают эфиром (100 мл), образовав- 40 шиеся кристаллы отфильтровыва1от, поомывают ня фильтре и сушат в вакуумзксикатОО " Получа7от 1,40 Г б"> ь) продукта

26 7-,1;- о » (-„2, 2п -7о

МеОН), Rf: 0,67 (хлороФорм:ь7етанол;32Я,— 45 нзя уксуснаа кислота 60;45;20 (Г)), 0,71 (этилацетат;пиридин:уксусная кислота: Вода

45:20;6;11 (Д)), 0,35 (хлористый метипен:метанол:50-ная уксусная кислота 85;15:2 (Е)), М-трет-бутилоксикарбонлл-о-бензил- 50 тирозил-Д-аланил-гпицин (Ч1.

1,66 г (5,90 мМ) (III) растворяют в 20 мл метанола и глдрируют в присутствил паппадиевого катализатора в течение 3 ч. Катализатор отфильтровывают, Г ром7ывзют на 55 фильтре метанолом, фильтрат упаривают, Остаток растворяют в 5,90 мл 1 н. раствора едкого нзтра. К раствору добавляют 2,91 г (5,90 мМ) п-нитрофенилового эфира й-третбутилоксикарбонил-о-бензил-тирозина в 25 мл ДМФА, Реакционную смесь перемешивают и ри комнатной температуре в течение суток. Раствор упаривают, остаток растворяют в воде, зкстрагиру от эфиром (50 млу х 2), водный слой подкисляют 2 н. серной кислотой до рН =-2 и экстрагируют зтилзцетатом (70 мл х 3;. Зтичацетат промывают

Водой (50 мл х 2), добавля.от 50 мл vзопpопилового спирт" и упзрияают. Ост,":"".o:< з .rивают эфиром (150 мл), образовавшиес.: кристаллы отфильтровыва.от, промывают на фильтре эфиром, сушат в Вакуум-эксикаторе, Получают 2,62 г (89 Q поодукта с т.пл.

1QQ — 10Q 5 7„(<2j - =-9 3 (С1 ДМФА) ff.

0,74 (Д), 0,57 (Е), 0,36 (хлороформ;метанол:уксусная кислота 9:1:О, (Ж)). и-Нк7трофениловый эфир М-трет-СутилоксикЯрбон ил-О-бензил-тирОзил-Д-зланилглицина (Ч).

3,50 г (7,03 мМ) (И) и 1,02 г (7,33мМ, п-нитрофенола растворяют В 25 мл ДМФА, растВОр oxffB>Kpают до -25 С, добавля.:От

": 54 г (7,33 мМ) дицикпогексллкарбодиимида в 10 мл ДМФА. Реакционну:.о смесь пере мешивзют при -25 C B течение 45 мин, затем температуру доводят до О С и Выдерживаю;

Г<РИ Этой тЕМПЕРЗт, РЕ В ТЕЧЕНИЕ СУТОК. ЕЬ павшие кристаллы дицлклоге,<силмзчепti! H ь

Отфильтровыва7от, промывают ня фильтрзте

ДМФА. филь-. рат упаривают, остато< пере", ристaffë ff Bñ B ö f! B è-: из изоп ропилово го

СПИрта. ПОЛуГЧЗЮт "-,63 f- Г83,.) ПрадуКта r.

0,87 (Е), 0,69 (

Ди-

-глицил-фенилапанил-лейцил-глутам ::новой кислоты (И).

209 мГ (О:,32 vi.4) (I I) растворяю г В 15 мл метанола и глдрируют В прис.тствии паяла диеВОГО катализатора В течение 3 ч, КЯ зл.fзатор отфильтровываю . промызя о-: HB фильтре метанолом, флпьтр упаривают. Остаток растворяют В 10 мп ДМФА и,:-;обавляют 200 мг (V). FeB<öèîH 7ую смесь перемешивают при комнатной темг7ературе в течение суток. ДМФА уг7аривз,от, остаток дважды переосаждают из метанола (5 мл) эфиром (300 мл), получают 266 мг (847) ffpcдукта с т.пп, 200 — 201 С, (а ia = -19,2 (С1, ДМ ФА), Rf . 0,88 (Г), 0,89 (Д), 0,58 (Ж).

Тирозил-Д-аланил-Глицил-фенилаланил-лейцил-ГлутаминсВзя кислота.

240 мг(0,24 мМ} (Vl) расгвапяют в 15 мл уксусной кислоты и Гидрируюг в присутствии паппздиевого катализатора в течение 3

1460965 ч. Катализатор отфильтровывают, промывают на фильтре уксусной кислотой и фильтрат упаривают, Остаток растворяют в 15 мл трифторуксусной кислоты и выдерживают в течение 30 мин при комнатной температуре.

Раствор упаривают, остаток заливают 50 мл эфира, выпав 3Y>é Осадок Отфи»1ьтровыва»ОТ, промывают:- г ф:;r üT.:;..е эфир:.»м, растворяют в 50 м"; 10",—.;о уксусной;:и» лоты и Обра", ать, ч *«Г ьонг . »м;=. .»-ной Г молпй "Оа!иех- " в тсг «««О..»м;, . ù,!>«. ;.:,>«t""°. ;ь -ров вгют про-! Вают на «и > -. rQ6 10 ной >«»к» >»оной KAQ лот ". .!>I. » ? и;:: ..»3= "- » у. -»BQI>I«-:a!Qr.. »Олуч6нный

Itr>«>»! >-.К . ОЧ >«!!!R!!.,Т M=ГОВО»,«I ->РОт;» ВОТОЧНОГО !aсп> . 6. ел -. !ия:-,;-;: ла> 6Tap r>й центрифуГ8

В СИСТЕМ6 Н-бу ьн»зл;уКС, QÊaÿ КИСЛОта:ВОда

4:,-"», стгци:." -.Яр ."": фг- а — Органическая.

Фогкп и СГ>де «жг»»Ц>>:- t«BAet»Q» !1!PQ»«t»K собир,— т, упгривггот, «Гоб» Вляю 50 м-1 изопропиловс .-О с.:-.:.:.-. --:=., упяри"a!Q-. Остаток, п8р8оса цгют из м= :Боля,,3 мл)» эфиром 2 0 мл1„ :»бг»гз«овави»и»й>ся Осадок Отфильт ровывают; лоом = г..:т на фильтр8 зфирОМ, сушат В Bax >».";:-Зкс!,.г>оре, Пол /ча»от 92 МГ

»;-бс» » про,,„„, .;,, "-: » 9 Бс» С1 10о

АСОИ,», »",: 0.7- (Г». С,42 (Д), 0,48 I, I-I-бутанол;уксу Гь»ВГ» ки-..лс Я эода 1>:1:1), Данные гм»«>»но>.. -.леть»:.-Го - ->Г >изг: «=,.-»анин 1,02 (1), Г»»и;>ин 0 =,!1.. »,«T.:ì!»> ..Овая к" QJlGTa 1,04

jl))« .гйцин . >02 i », — .розин 0,99 (l), фенилалгнин 1,03 f)!; - ннь =. . Высокоэффективной

«:и :-:гс -: "О.й;;: О, ="-. ГГ >-ряфии: пептид злюиров >лся, »«*..:>.:«„.»:-и " -1;," ЯЯ,»4О/ »Оадиента к г " 2. > =;: . и н: ..:,:- " ". к г 250 х 4,6. Мм, -: 31(ггврпе>г ..: ."-. ;.::"«Движ..»ая фаза А 0.05«

>»у» Кф- " » >», = -13« "» О" ЯО 5- 30») Я за 20 мин,,—, вле»."ие 1! 55 ".. > Г>Ь «скорость 1 мл/мин, Д" к. »»» «:"О»»» 2 . >»«>« - >В>>> >>a»> -.Н»С! t> «ОЛУ", ВННОГО f QeÄI»I нения Г»одтвержда:-От спектром ПМР. (»Вове» 8>ны б»лол»Г>г;>«чес>х»лз испытания

î:-! исы Ваемого гвк»л::-.пептидг.

П р и м 8 р 2, Испь»тгк.;Я прстиаоязвенно» и действ>»»я Гексапептида пООВОдят На

f крысах самцах линии Е .истер. РЯЗВитие Язвенных поражений двенадцатиперстной кишки у крыс вы".-ы«aIQx путе>и подкожного введения цистег, «ина Гидрохг»орида В дозе

350 мг/::.;., разведенного в 0,5 мл физиологического раствора. Сразу же после введения ци:,.Теа».ина гидрохлорида и через 6 ч крысам с помощь>-".: Внутрижелудочного зонда Вводят Внутрь предл-г-аемый гексапептид В дозах 10 и 100 мкг/ r, деларгин в дозе

1 0 мкг/кг или циметидин в дозе 10 мг/кг, растворенные В 05 мл 3,4-нога молока, ра3веденного В;, раз физиоло-ическим раствоОом, Кэнтрольной Группе жиВОтных после

Введения цист8яминг Гидрохлорида ВВОдят

Внутрь 3$ >кое; олОко> ра368ценное В 5 раэ физиологическим раствором. Забой живо«ных производят методом декапитации через 24 ч после Введения цистеамина гидрохлорида и с помощью бинокулярной

5 лупы (Х8) оценивают состояние слизистой

Оболочки двенадцатиперстной кишки, Для ! .. Ждой Q» »гь!. >: Крыс по» сч»» > ываю» сред н:ою тяжесть порагк."-.Ния ТП), Выраженную

В Ог лл ах (О Отсутств и 8 3 роз и в н О-Я 3 В 8 н н ы х

10» - О» - 6 - и»»> 1 — яро..и.>! 2 едини>»нгя Язва; ." — множественн -:c язвы, 4 — прободные

;=;.-::=«). Кроме того, в каждой группе Опреце> л .:;11 час 61"»» поражений (ЧП), котоогЯ ":per»-:;":;-.В .Лет собой Отношение числа животных

; Е .-:звзми к Общему - > слу выживших к концу

; —.;:.:c„ ..-:.::Гмента животных, В качеств уммзрнerQ гоказателя язвообразования опре.,ГС»я»вт;СЛОВНЫй ЯЗВВННЫй ИНДЕКС (ЛИ). .. 0 (т««п>«(. » >>>чесмо Обработку полg÷eHн ых ре3«-.,ь .:--Qa ПрОВОЛят С Г;ОМОШЬЮ t-Критгрия

Сть Одента, для ТП) и Х" -критерия Пирсона л;, ЧП). За до=товерные принимают разли :. в «-=.;- ровне значимости 95 4,(при Р<0,05).

25 П:"л .,«>:енные результаты представлены в

»,, Кзк стедует из табл,1, предлara8! ;II!

;8; г>!3!»тид! ри Введении Внутоь зависимо

О;: .3:. Г>ре»отврашге: Язвообргзование В

30 дзен-1;,цгтиперстной кишке крыс и снижает

ЯИ В гпе 100 мкг/к» на 63;. Противоязвенная активност;. гексапептида в дозе 100 мкг/кг аылг несколько Выше противоязвенной ак-,ивности циметидина в дозе 10 Mr/кг.

35 Де:-гргин при введении внутрь обладал слабым прогивоязвенным действием, снижая

Яь, лишь .«Я 26/»>«Г>ричем зтО снижение не a- >a !Qcь с:. атичепки 3!.»Ячимым.

П р и м 8 р 3. Гексапептид i был изучен

4о е зкс»".ериментальной модели индгметациновь-:., ЯЗВ тонко-о кишечника, где про»ицо;:3векнОе дейс вие гексагептида сра--, ьжа.".И» с противоязвенным действием сульфа:,".Яль>зина. ИндОметгцин вводят кры45:. Вл.:. Вн :трь В Дозе 20 МГ/кГ с помощью Внутрижелудачного зонда в виде суспензии в 0,5 мл физиоло;-ического раствооа. Предлагаемы» Гексапептид в Дозе i 00 мкгl кг или сульфас:- .азин В до е 200 мг/кг вводят сразу же

50 и через 6 ч после введения индометацина в

0,5 к-:л разбавленного в 5 раз Физиологическим раствором 3;4-ного молока. Контрольной Группе »сивотных сразу же и через 6 ч посля введения индометгцина вводят

55 внутр . 3-",ь-чое молоко, разведенное в 5 раэ физиологическим раствором. Забой животных методом декапитации производят через 24 ч после введения индометацина и подсчитывают с помощью бинокулярной лупы количество язвенных дефектов слизи1460965

Влияние гексапептида I, циметидииа и деларгииа на возникновение цистеаминовых дуоденальных язв пои приеме внутрь

Ц ела пги .в

f (100 мкг/кг)

1,620, tg

* Различие - контрольной гр,ппой на уровне энач...,мост,, 050/, (ри Р (0,05) аоли JB 2

Влияние предлагаемого гексапептида и сульфасалазииа на развитие индометационовых язв в тонком кишечнике крыс. ппы животных Количество животных

Среднее количество язв

48.78 6,02

К онтроль

1 Гредла Гаемы й

Гексапеп

20

5,61 % Я* эО, 8

27,50

Различие с контрольной Группой достоверно на уровне значимости 95,4 (при Р < 0.,05) Составитель В.Волкова

Редактор M.Êó3H8öoâB Техред M.Moðãåíòàë Корректор М,Демчик

Заказ 4593 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 стой оболочки 30-сантиметрового дистального отрезка тонкой кишки, где возникновение язв было максимальным. Для каждой группы определяют среднее число язв в киШЕЧНИК8. 5

Статистическую Обработку получен и ы х результатов проводят с помощью T-критеpNA Стьюдеита. За дОстоверные принимают различия иа уровне значимости Q5$ (при

Р<0,05). Полученные результаты представ- .О лены в табл.2.

Как следует из табл.2, предлага8мый

Гексапептид ), испОльзованный в Дозе 100 мкГ/Kf, снижает среднее кОличество язв в

ДистальиОЙ части тОнкОГО кишечника крыс 15 на 52$. Противоязвенная активность предлагаемого гексапептида 1 не уступает противоязвенной активности сульфасапазина, примененного в дозе 200 мг/кг, который уменьшает количество язв в кишечнике на

46 о

Во всех экспериментах с применением предлагаемого гексапептида t не отмечалось изменения со стоооиы клеточного состава крови ocHGBHbtx гемодииамических показателей. Острая токсичность предлагаемого гексапептида I f Bg составляет 250 мг/кг.

Таким образам, синтезиооваи новый гексапептид формулы I. Который обладает низкой TGKcM -fHGOTüþ, более уни88рсальиыь, ПРОТИВОЯЗВЕНИЫМ лейстВИЕМ - 8Ó ЦИМ8, дии или супь асалазин, превышает активНОсть зтих пбепаратов в 100 и 2000 раз.