Способ обнаружения о-антигенов грамотрицательных бактерий в биологическом материале

Способ обнаружения о-антигенов грамотрицательных бактерий в биологическом материале

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к медицине , а именно к методике экспрессдиагностики инфекционных заболеваний , вызываемьк грамоотрицательными бактериями (брюшной тиф, сальмонеллезы. дизентерия и др.) Целью изобретения является повышение чувствительности способа за счет обработки эритроцитов протеолитическими ферментами и формалином и обработки исследуемого образца трилоном Б и щелочью при 50-60 С. Дпя этого берут пробу мочи, центрифугируют ее для освобождения от взвешенных частиц, добавляют раствор динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (трилона Б), встряхивают , освобождают от низкомолекулярных соединений гель-хроматографией на гелях, разделяющих молекулы с молекулярной массой не более 30000 дальтон, фракцию, объем выхода которой равен внешнему объему геля, обрабатьшают щелочью при 50-60, ней. трализуют щелочь, адсорбируют 0-антиген при 50-55 с на эритроцитах, предварительно обработанных протеолитическим ферментом, а затем формалином , выявляют адсорбировавшие 0-антиген эритроциты с помощью агглютинации их специфической антисьшороткой. Способ высокочувствителен.(3 - 6 нг/мп). Для получения ответа необходимо затратить не более 2,5 чо S (/) 4 Од OD СО

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5п 4 С 01 N 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABT0PCHGMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4170647/ 28-14 . . (22) 27. 11,86 (46) 28,02,89. Бюл. М - 8 (71) Киевский научно-исследовательский институт эпидемиологии и инфекционных болезней им. Л.В.Громашевского (72) А.Ф.Фролов, М.И.Грутман, С.Л.Ягуд, P.Í.Íàãîðíàÿ-Персидская и И.И.Ногачевский (53) 612.015(088.8) (56) Журнал эпидемиологии, микробиологии и иммунологии, 1947, У 2, с.25-31..(54) СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ О-АНТИГЕНОВ

ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ (57) Изобретение относится к медицине, а именно к методике экспрессдиагностики инфекционных заболеваний, вызываемых грамоотрицательными бактериями (брюшной тиф, сальмонеллезь! дизентерия и др.). Целью изобретения является повышение чувствительности способа за счет

Изобретение относится к медицине, а именно к методике экспрессдиагностики инфекционных заболеваний, вызываемых грамотрицательными бактериями (брюшной тиф, сальмонеллезы, дизентерия и др.) .

Цель — повышение чувствительности способа за счет обработки эритроцитов протеолитическими ферментами и формалином, и обработки исЛ0„„1462199 А 1 обработки эритроцитов протеолитическими ферментами и формалином и обработки исследуемого образца трило(Р ном Б и щелочью при 50-60 С. Для этого берут пробу мочи, центрифугируют ее для освобождения от взвешенных частиц, добавляют раствор динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (трилона Б), встряхивают, освобождают от низкомолекулярных соединений гель-хроматографией на гелях, разделяющих молекулы с молекулярной массой не более

30000 дальтон, фракцию, объем выхода которой равен внешнему объему геля, обрабатывают щелочью при 50-60, ней= трализуют щелочь адсорбируют О-анЭ тиген при 50-55 С на эритроцитах, предварительно обработанных протеолитическим ферментом, а затем формалином, выявляют адсорбировавшие

О-антиген эритроциты с помощью агглютинации их специфической антисывороткой. Способ высокочувствителен (3—

6 нг/мл). Для получения ответа необходимо затратить не более 2,5 ч.

2 следуемого образца трилоном Б и щелочью при 50-60 С.

Пример 1. Обработка эритрофитов. Баранью кровь взяли в равный объем раствора Олсвера. Эритроциты трижды отмыли от сыворотки

0,15 M раствором NaC1 и разделили на две части. Одну суспендировали о в нагретом до 37 С растворе Хенкса с рН 7,6, содержащем 0,27 трипсина, 3 146 а другую также в нагретом до 37 С растворе Хенкса с рН 7,0, содержащем

0,27. папаина. Обе пробы при постоянном помешивании проИнкубировали в . течение часа при 37 С, охладили в смеси льда и воды. Трижды отмыли на холоду охлажденным 0,15 М раствором

МаС1. Затем эритроциты суспендировали в 0,15 M растворе NaC1, содержащем 1,5Х формальдегида и проинкубировали при постоянном перемешивании

18 ч при 37 С. После этого эритроциты 5 раз отмыли в 0,15 M растворе

NaC1 и суспендировали в этом же растворе с добавлением консерванта (азида натрия в концентрации 1:1000).

Приготовленные таким образом эритроциты хранились в холодильнике 6 мес, т Ряя способности адсорбировать

О-антигены. Часть эритроцитов обработали формальдегидом, как это описано выше, без предшествующей обработки протеолитическим ферментом.

Взяли исходный раствор О-антигена брюшнотифозной палочки (концентрация

100000 нг/мл), полученного по методу Буавена и обработанного щелочью, и приготовили 4 ряда двухкратных разведений (в объеме 0 5 мл) в смеси, состоящей из равных объемов

0,15 M раствора NaCl и 0,15 М фосфатного буфера рН 7, 2, содержащей О, 27 желатина. Затем во все лунки добавили по О, 1 мл 1Е бараньих эритроцитов.

В первый ряд добавили эритроциты, обработанные трипсином и формалином, во второй — обработанные папаином и формалином, в третий- - только формалином, в четвертый - нативные эритроциты. о Планшеты с реакционной смесью проинкубировали в течение часа при

55 С, тщательно встряхнув после перо вого и второго получаса инкубирования. Затем по 0,02 мл суспензии из каждой лунки поместили в лунки

U-планшет микротитратора Такачи, в которые предварительно было разли д по 0,02 мл сыворотки против брюшнотифозной палочки, Из chIBopOTKH были адсорбированы антитела против бараньих эритроцитов. Планшеты с реакционной смесью проинкубировали в течение 15 мин при 37 С а затем их отцентрифугировали при 175 g в течение 5 мин и произвели учет реакции.

Чувствительность способа при применении эритроцитов, обработанных

2199 трипсином и формалином, составила

3 нг/мл, папаином и формалином

3 нг/мл, одним формалином 50 нг/мл, 5 при применении нативных эритроцитов — 25 нг/мл.

Таким образом, применение для определения О-антигенов эритроцитов, обработанных последовательно протеолитическим ферментом и формалином, повьппает чувствительность способа по сравнению с прототипом, согласно которому для определения О-антигенов применяются нативные эритроциты, в 8 раз. Обработка эритроцитов трипсином и папаином в одинаковой степени повьппает чувствительность способа.

Применение эритроцитов, последовательно обработанных протеолитическим ферментом и формалином, обеспечивает более высокую чувствительность способа по сравнению с применением эритроцитов, обработанных лишь одним формалином.

25 Пример 2. К 8,5 мл мочи добавили 0,5 мл 0,15 М раствора NaC1, содержащего 1000 нг О-антигена брюшнотифозной палочки. Перемешали. Отцентрифугировали при 2000 g в течеgp ние 5 мин. Надосадочную жидкость отсосали и к ней добавили 1 мл 25 мМ раствора динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (трилона

Б) с рН 8,5, так, что конечная концентрация трилона Б составила 2,5мМ.

35 О

Пробу нагрели до 37 С и встряхивали в течение.5 мин при 37 С. По 1,5 мл реакционной смеси наслоили на 5 порций по 12 мл геля сефадекс G-50, помещенных во вкладыши с сетчатым дном, на которое была уложена фильтровальная бумага. Вкладыши были вставлены в центрифужные пробирки. Для удаления дистиллированной воды, находившейся между гранулами геля, перед опытом сефадекс отцентрифугировали при 175 g в течение 20 мин. После нанесения исследуемых порций мочи пробирки с сефадексом вновь отцентрифу50 гировали в течение 15 мин при 175 g.

Собравшуюся на дне центрифужных пробирок жидкость, содержащую О-антиген, отобрали в мерные пробирки и добавили 2,5 н раствор NaOH до. конечной концентрации 0,25 н. Пробы прогрели при разных режимах: первую пробу согласно прототипу прогрели в кипя щей водяной бане в течение 6 мин, остальные пробы прогрели в течение

1462199

Формула и 3 о б р е т е н и я

Составитель Л.Сабурова

Техред М.Дидык

Редактор Н, Горват

Корректор В.Гирняк

Заказ 668/42 Тираж 788 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/S

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101

6 мин при следующих температурах: вторую — при 65 С, третью — при

60 С, четвертую — при 50 С, пятую— при 45 C. Пробы охладили, нейтрализовали соляной кислотой, используя в качестве индикатора водный раствор бромтимолового синего. Сделали двухкратные разведения (в объеме 0,5 мл) каждой пробы в смеси, состоящей из равных объемов 0,15 M раствора NaC1 и 0,15 М фосфатного буфера рН 7,2 и содержащей 0,2 желатина. Затем во все лунки добавили по 0,1 мл 1 бараньих эритроцитов, обработанных трипсином и формалином (пример 1).

Дальнейшая постановка реакции пассивной гемагглютинации проводилась, как это описано в примере 1.

Для определения количества выявленного 0-антигена растворили полученный по методу Буавена и обработанный щелочью антиген брюшнотифозной палочки (концентрация 200 йг/мл) и сделали двухкратные разведения. Добавили эритроциты, обработанные трипсином и формалином и поставили реакцию пассивной гемагглютинации (пример 1).

По данным результатов реакции пассивной гемагглютинации в первой пробе было выявлена 3 нг 0-антигена, во второй 25 нг, в третьей

100 нг, в четвертой 100 нг, в пя той 50 нг.Таким образом, прогревание 0-антигенов в 0,25 н растворе щелочи в течение 6 мин при температурах 50—

60 С обеспечивает максимальную чувствительность способа определения

0-антигенов. В этом случае чувствительность возрастает в 32 раза по сравнению с прототипом, согласно которому пробу прогревают на кипящей водяной бане.

10 Прогревание 0-антигенов в 0,25 н о растворе щелочи при 50-60 С обеспечивает также более высокую чувствительность по сравнению с прогреа ванием при более высокой (65 С) и о

15 более низкой (45 С) температуре.

Способ обнаружения 0-антигенов

20 грамотрицательных бактерий в биологическом материале, включающий взятие пробы биологического материала, обработку щелочью, нейтрализацию щелочи,адсорбцию 0-антигена на эритроцитах, выявление адсорбированных антиген эритроцитов с помощью иммунной сыворотки, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, к пробе

30 мочи добавляют 2,0-3,0 мИ трилона Б, встряхивают, подвергают пробу гель фильтрации, обработку щелочью проводят при 50-60 С, а 0-антиген адсорбируют при 50-55 С на эритроцитах, предварительно обработанных трипси35 ном или папаином с активностью 3 5

16 ед/мп и формалином.