Способ получения изолированных клеток печени
Иллюстрации
Показать всеРеферат
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
„.SUÄÄ 1463757 А 1
15@ 4 С 12 N 5/00
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
Я И .ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬС ГИУ (21) 4221432/31" 13 (22) 02.04.87 (46) 07.03.89. Бюл. I« 9 (71) Институт проблем криобиологии и криомеднцины АН УССР (72) Л.Н Кравченко, А.Н. Андриенко, О,А. Семенченко, А.N. Петренко и А.Н. Сукач (53) 578.085.23 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР
У 1310426, кле С 12 N 5/00, 1985.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в клеточной биологии и экспериментальной медицине, Целью изобретения является повышение функциональной активности изолированных клеток печени.
П р и и е р I. Перфузию печени животных весом 200-250 r проводят
in situ. Для этого вскрывают брюшную полость анестезированных животных, вводят инъекционную иглу в воротную вену и закрепляют лигатурой,а нижнюю полую вену надсекают в месте ответвления правой почечной вены для оттока перфузата. На первом этапе отмывку печени от крови проводят раствором Локка (рН 7,6) в течение 1015 мин при температуре раствора 37 С
Состав раствора Локка, г/л:
Хлористый натрий 9,00
Хлористый калий 0,42 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗОЛИРОВАННЬП(.
КЛЕТОК ПЕЧЕНИ (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в клеточной биологии и экспериментальной медицине ° Цель изобретения — повышение функциональной активности изолированных клеток печени. Для получения гепатоцитов перфузию органа проводят в два этапа раствором Локка, причем на втором этапе в растор вводят ЭДТА, а дезагрегацию проводят с помощью ультразвука в среде, содержащей хлористый кальций. 4 табл.
Лимоннокислый натрий 7, 90
С:
Двууглекислый натрий 0,30
Глюкоза 1,80
Дистиллированная вода Остальное Оа4
Раствор пропускают со скоростью «ф»
25 мп/мин в течение IO-I5 мин (объем
250-350 мл). На втором этапе перфузию проводят раствором Локка, в который вводят 2 мХ ЭДТА (рН 7,4).
Перфузию осуществляют с той же скоростью, расход перфузата 6СО700 мл. Общее время перфузии 3040 мин. После окончани перфузии печень извлекают из брюшной полости, измельчают ножницами в сахарозной р среде, содержащей 1,2 мИ.
Состав среды дезагрегации, г/л:
Сахароза 86 000
Хлористый калий 0,372
Фосфорнокислый калий однозамещенный 0,054 .
Фосфорнокислый натрий
-1463757 двузамещенный 0iO7l
Хлористый магний 0,076
Хлористый . кальций О, 180
Альбумин 10, 000
Дистиллированная вода Остальное
Дезагрегацию осуществляют. с помощью вибрационного устройства при час готе 50 Гц в течение 60 с. Полученную суспенз.ию фильтруют через нейлон 10 проводят очистку первичной суспении гепатоцитов серией отмывок для даления поврежденных клеток. После того полученные клетки ресуспендирут в среде 199 с таким расчетом, что- 15
ы получилась оптимальная концентраия 1-3 х10 кл/мл (объем 150-200 мл), Количество неповрежденных клеток пределяют методом окраски трнпановым синим (0,4X).
Функциональную активность (уровень эндогенного дыхания, стимуляции эндогенного дыхания 1-5 мМ сукцинатом, содержание адениннуклеотидов) определяют как свежевьщеленных кле- 25 ток, так и после культивирования (в суспензии) .
Результаты опытов по определению выхода гепатоцитов (п = 10) приведены в табл. l. 30
Данные, представленные в табл. 1, свидетельствуют о том, что предлагае. мый способ позволяет получить жизнеспособные клетки печени,:которые не теряют своей функциональной активнос35 ,ти и после культивирования в суспензии в среде 199.
Клетки, получаемые по известному способу, прокрашиваются трипановым синим на начальных этапах культивирования.
В табл. 2 представлены биохимические показатели функциональной полноценности клеток (и = 10), полученных по известному и по предлагаемому спо- 4 собам.
Из табл. 2 видно, что уже на этапе вьщеления клетки характеризуются высоким эндогенным дыханием (в 5,2 раза превышает данные известного спо- б0 соба) ° Дыхание не изменяется в процессе двухчасового культивирования в условиях суспензии. Сукцинат (1-5 мМ) в норме, не проникающей через плазматическую мембрану, в 1,б раза меньше стимулирует эндогенное дыхание по сравнению с известным способом. КульI тивирование клеток, полученных по изобретению, не изменяет степень стимуляции эндогенного дыхания сукцинатом. Коэффициент дыхательного контроля сукцината (Ч,„ /V,„„„„) не превышает 1,33 у свежевьщеленных, в то время как для культивированных клеток он несколько ниже.
У полученных гепатоцитов при культивировании способность сохранять высокое содержание АТФ. значительно возрастает и достигает величин, харак- . терных для перфузируемой печени, что также является подверждением высокой функциональной активности получаемого материала.
Пример 2. Способ осуществляют.аналогично примеру 1, но с тем отличием, что ерфузию печени осуществляют только раствором Локка (без добавления ЭДТА на втором этапе) (табл. 3).
Из табл. 3 видно, что перфузия печени раствором Локка, не содержащим хелатирующего агента ЭДТА, приводит к значительно меньшему выходу функционально полноценных клеток (в расчете на влажный вес печени).
Пример 3. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но с тем отличием, что дезагрегацию клеток проводят в сахарозной среде, используемой в прототипе (без СаС1 ).
Результаты приведены в табл. 4 (n = 4).
Из табл. 4 видно, что при дезагрегации клеток в среде, используемой в известном способе, количество †жизнеспособных клеток резко снижается.
Формула изобретения
Способ получения изолированных клеток печени, включающий перфузию органа с последующей его дезагрегацией в сахарозной среде с помощью вибрации, отличающийся тем, что, с целью повышения функциональной активности клеток, перфузию органа проводят в два этапа, раствором Локка, причем на втором этапе в раствор Локка вводят ЭДТА в количестве 2 мИ, а среда дезагрегации содержит хлористый кальций в количестве 1,2 мМ.
1463757
Таблица l
Колич е ст во кл е то к, 7.
Количество клеток, млн
Способ на вес на 1 г пепечени чеки
Свежевы- После кульделе нные тивиров ания
Известный 586117 58,0+2,0
Предлагаемый 236220 26,3<4,0
3+0,5
9421,8
98 0, 4.
91+2,0
Т а б л и ц а 2
Спо соб 7 у цд (НМО,A lO кл/мин) СЗКк, / На к (Hl IOð
«10 кл/мин) Содержание АТФ; нМ на 10 кл. веже- Культиыде- вироенные ванные
Свеже- Культивыде- вироленные ванные
Свеже вы- Культиви-. деленные рованные Известный 2,32+
<0,3
4,8+0,3
2,06
17,3+1,9 22, 7+
+2,1
20,6+ 1 «33 1,20 22,1+-3,0 41,2+5,0
+1,9 .
17, l+
-2,0
Таблица 4
Т а.б л и ц а 3
Способ перфузии
Количество клеток на вес печени, млн ноценных клеток, 7
Раствором Лок— ка одиозтапно 78,5+0,8 81+2,5
Предлагаемый 236,0+2,0 9112,0
75 й3,0
9!+2,0
Со ставитель О. Жакетов
Редактор Г.Волкова Техред Л.Олийнык Корректор Н. Король
Заказ 790/31 Тираж 500 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Производственно-издательский .комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,101
Предлагаемый
Колич е ст во функционально полСвеже- Культивыде- вироленные ванные 0. Известный способ
Предлагаемый способ
5,8+0,7
236+2,0