Способ проведения иммуноанализа

Способ проведения иммуноанализа

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к методам проведения иммуноанализа и может быть использовано в медицине, сельском хозяйстве, промьшшенности для определения биологически активных соединений. Целью изобретения является увеличение чувствительности иммуноанализа . В качестве метки при проведении иммуноанализа использованы соединения класса металлопорфиринов, которые способны интенсивно фосфоресцировать. Проведение иммуноанализа включает получение реагентов , ковалентно маркированных металлопорфиринами, проведение иммунологических реакций, в том числе с участием меченных соединений, и детекцию специфического связывания по фосфоресценции метки. Детекция проводится с микросекундным временным разрешением в растворе при комнатной температуре или в жидком азоте. Чувствительность способа составляет 0,05 н.моль/л. 4 ил. i (Л

ССИС)з СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (19) (11) 4089 А1 (51) 4 С 01 N 33/53

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4201377/28-14 (22) 25.02.87 (46) 07.03.89. Бюл. № 9 (71) Институт биохимии им.А.Н.Баха (72) А.П.Савицкий, Д.Б.Папковский, И.В.Березин и Г.В.Пономарев (53) 612.015(088.8) (56) Патент США ¹- 4374120,кл.436/546, 1983.

i(54) СПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ HMMYHOAHAJ: (57) Изобретение относится к методам проведения иммуноаналиэа и может быть использовано в медицине, сельском хозяйстве, нромьпппенности для определения биологически активных соединений. Целью изобретения является увеличение чувствительности имИзобретение относится к методам проведения иммуноаналиэа и может быть использовано в медицине, сельском хозяйстве„ промышленности для определения биологически активных соединений.

Цель изобретения — увеличение чувствительности способа за счет использования металлопорфиринов в качестве маркеров.

На фиг. 1 приведен спектр поглощения Pd-копропорфирина I в водном растворе (максимумы поглощения

396,514 и 548 нм); на фиг. 2 — корректированный спектр испускания Pdкопропорфирина 1; на фиг. 3 — зависимость интенсивности люминесценции от концентрации: 1)РЙ-копропорфирин

I (возбуждение при 395 нм, регистрамуноаналиэа. В качестве метки при проведении иммуноанализа использованы соединения класса металлопорфиринов, которые способны интенсивно. фосфоресцировать. Проведение иммуноанализа включает получение реагентов, ковалентно маркированных металлопорфиринами, проведение иммунологических реакций, в том числе с участием меченных соединений, и детекцию специфического связывания по фосфоресценции метки. Детекция проводится с м кросекундным временным разрешением в растворе при комнатной температуре или в жидком азоте. Чувствительность способа составляет

0,05 н.моль/л . 4 ил.

2 ция при 665 нм); 2) европий (возбуждение при 337 нм, регистрация при

616 нм); на фиг. 4 " калибровочная кривая для определения моноклональных антител твердофазным методом (концентрация меченных антител на второй стадии 30 н.моль/л) .

Пример 1. Получение Pd(2+)копропбрфирина I. К раствору 72,7 мг копропорфирина I дигидрохлорида в

40 мл ледяной уксусной кислоты добавляют приготовленный раствор 75 мг .PdCl в 15 мл свежеочищенного диметилформалина и нагревают смесь в течение 1 ч при 120 С (спектрофотометрический контроль при длине волны

620 нм до полного исчезновения полос поглощения безметального порфирина в растворе диметилформамида). К ro1464089 рячему раствору добавляют 1,5 мл во, ды и постепенно охлаждают до комнатной температуры. Выпавший кристаллический осадок отфильтровывают, промывают 10 мл уксусной кислоты, затем водой и этанолом и высушивают в вакуумном эксикаторе. Выход Pd(2+)копропорфирина I 65 мг (85,7 ). Спектры поглощения и фосфоресценции при- 10 ведепы на фиг. 1 и 2. Время жизни фосфоренсценции в обескислороженном водном растворе при 20 С 0,67 мс.

Квантовый выход фосфоресценции 0,20. !

Пример 2. Получение антител, 15

1 маркированных Pd (2+) -копропорфирином

I. К 1 мг Pd(2+)-копропорфирина I в

1 мл воды добавляют 1,5 мг 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)карбодиимидамето-и-толуолсульфоната и инкуби- 20 руют 15 мин, поддерживая рН 5,8-6,2. Полученный раствор добавляют к 20 мг моноклональных антител, растворенных в 2 мл О, 1 М карбонатного буфера, IpH 9,0, и инкубируют 3 ч в темноте. ( Полученный раствор хроматографируют на колонке с носителем Тоуореаг 1 HW55, собирая фракции белкового пика. Содержание Pd(2+)-копропорфирина в меченном белке определяют по погло- 30, щению при длинах волн 280 и 390 нм.

Чувствительность детекции на импульсном люминесцентном спектрометре 1.8-5 (Perkin Elmer) c временньж. разрешением антител, меченных Рд-копропорфирином I (состав 1:3), ве уступает чувствительности европневой метки, в определении на этом же приборе, и составляет 0,01 нИоль/л {фиг.3) .

Пример 3. Проведение твердо- 40 фазного иммуноанализа. На. поверхность полистирольных пробирок адсорбируют антитела кролика против глобулинов мыши из 1 мл 0,1 М карбонатного буфера в концентрации 10 мкг/мп в течение 3 ч при комнатной температуре.

Затем раствор выливают и промывают пробирки 3 раза фосфатно-солевым буфером с Тритоном Х-100 (К-фосфат

0,01 М, рН 7,4, ИаС1 0,15 М, 0,05%-ного Тритона Х 100; ФСБТ) .

В пробирки с адсорбированными антителами наливают по 1 мл стандартных растворов моноклональ ных а нтит ел в

ФСБТ и инкубируют 1 ч при 37 С. После этого растворы выливают, промывают пробирки 2 раза ФСБТ, заливают в них по 1 мл ФСБТ, содержащего 10 мкг моноклональных антител, меченных

Pd-копропорфирином I, и инкубируют

1 ч при 37 С в темноте.

Затем растворы сливают, промывают пробирки 3 раза ФСБТ, заливают в них по 1 мп десорбирующего раствора (О, 1 M Na0H) . Чер ез 20 мин добавляют

0,1 мл 1 М раствора бисульфита натрия и измеряют интенсивность фосфоресценции.

Пример 4. Регистрация фосфоресценции. Возбуждение проводят азотным лазером (337 нм) с частотой 50 Гц и полушириной вспьппки 10 нс. На регистрации используют фильтры, отсекающие кванты с длинами волн менее б 20 нм. Hp емя зад ержки О, 3 мс, сч ет

О, 7 мс > время счета 1 с. Калибровочная кривая приведена на фиг. 4. Чувствительность анализа О, 01 нмоль/л.

Формула изобретения

Способ проведения иммуноанализа путем получения антител или антигенов, меченных люминесцирующими соединениями, проведения иммунохимической.реакции с последующей детекцией специфического связывания по интенсивности люминесценции, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью увеличения чувствительности способа, в качестве люминесцирующего соединения используют фосфоресцирующие металлопорфирины, а детекцию специфического связывания ведут по интенсивности фосфоресценции.

1464089

400

1464089

Ф,O

g ИЕ(Ц

3$

Я,О

Составитель А. Сабурова

Редактор И. Горная Техред М,Дидык Корректор Н. Король

Заказ 819/48 Тираж 788 Подписное

ВЯЯИПК Государственного комитета по иэобретенням и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Проиэводственно-иэдательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина,101