Способ определения активности антитромбина ш в плазме крови

Способ определения активности антитромбина ш в плазме крови

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к лабораторной диагностике. Цель изобретения - повышение точности способа в условиях гепаринотерапии. Рабочий раствор тромбина прогревают и добавляют к нему исследуемую дефибринированную адсорбированную плазму, которую предварительно обрабатывают сульфатом бария. После инкубации смесь переносят в пробирку с раствором фибриногена и регистрируют время свертыван-ля. По калибровочной кривой находят процентное содержание антитромбина III. 5 табл. (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5И 4 G 01 N 33/68

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ЮИИЗЩ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4194462/28-14 (22) 13 ° 02.87 (46) 07.03.89. Бюл. И 9 (71) Алтайский государственный медицинский институт им. Ленинского комсомола (72) С.И.Белых (53) 6 12.015(088.8) (56) Балуда В.П., Биркаган З.С., Гольдберг Е.Д. и др. Лабораторные методы исследования системы гемостаза./ Под ред. Е.Д.Гольдберга.

ToMcK; ToMcKHH мединститут, 1980, с. 199.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике нарушений свертываемости крови.

Цель изобретения — повышение точ-. ности способа в условиях гепаринотерапии.

Цель достигается тем, что в способе определения активности антитромбина (AT) III в плазме крови, включающем связывание AT III дефибринированной плазмы экзогенного тромбина, где об активности AT III судят по активности остаточного тромбина, удаление гепарина из плазмы осуществляется путем адсорбции сульфатом бария.

Способ осуществляют следующим об, разом.

Реактивы: 3,8Х-ный раствор цитрата натрия, буфер Михаэлиса, рН 7,4, рабочий раствор тромбина (Каунасское предприятие бакпреларатов) в буфере.;

ÄÄSUÄÄ 1464090 А1

{54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

АНТИТРОМБИНА III В ПЛАЗМЕ КРОВИ

{57) Изобретение относится к лабораторной диагностике. Цель изобретения — повышение точности способа в условиях гепаринотерапии. Рабочий раствор тромбина прогревают и добавляют к нему исследуемую дефибринированную адсорбированную плазму, которую предварительно обрабатывают сульфатом бария. После инкубации смесь переносят в пробирку с раствором фибриногена и регистрируют время свертывания. По калибровочной кривой находят процентное содержание антитромбина III. 5 табл.

Михаэлиса, рабочий раствор фибриногена (Каунасское предприятие бакпреларатов) в буфере Михаэлиса, сульфат 1® бария. 4ь

Приготовление исследуемой плазмы. фф

Из вены обследуемого силиконирован- ф» ной иглой берут кровь и смешивают ее в силиконированной пробирке с CO

3,87-ным раствором цитрата натрия в «>ив соотношении 9:1, затем центрифугируют 6 мин при 300 об/мин. Снимают бо1гатую тромбоцитами плазму и вновь центрифугируют ее в силиконированной пробирке при 1200 об/мин в течение 20 мин. В полученную бедную тромбоцитами плазму добавляют сульй ,фат бария из расчета 900 мг/мл, затем в течение 5 мин тщательно пере" мешивают их стеклянной палочкой.

После этого центрифугируют при

300 об/мин б мин. Плазму снимают.

1464090

Проверки качества адсорбции проводятся с помощью определения протромбинового времени по Квику, которое в хорошо адсорбированнОй плазме должно превышать- 3 мин при активности добавляемого тромбопластина (проверяется на контрольной нормальной плазме) 15-20 с. Адсорбирова» ную бедную тромбоцитами плазму прогревают на 10 о водяной бане при 56 С в течение

5 мин. Пс" че тепловой дефибринации осаждают фибриноген центрифугированием (10 мин при 1200 об/мин). Надосадочный слой СННМВ»ОТ для проведения 15 исследования.

Приготовление рабочего раствора тромбина. Разводят тромбин в небольшом количестве буфера Михаэлиса (маточный раствор). Часть маточного ра- 2п створа постепенно разводят буфером

Иихаэлиса, проверяя его коагуляционную активность добавлением 0Ä2 мл раствора тромбина к 0,3 мп раствора фибриногена. Свертывание должно происходить за 15-1б с. При избыточном разведении для повышения коагуляционной активности добавляют маточный раствор тромбина. Рабочий раствор тромбина готовят непосредственно пе- ЗО ( ( ред исследованием, так как он быстро теряет свою активность.

Приготовление рабоч его раствора фибриногена. Навеску сухого фибриногена растворяют в буфере Михаэлиса до концентрации О,бй. За.тем по методу Рутберг определяют "одержание коагулирующего белка (с добавлением

15-секундного тромбина) и вновь до. бавляют буфер .»1ихаэлиса, доводя кон- 40 центрацию коагулирующего белка до .0,4Х.

Ход определения. В силиконированную пробирку набирают 0,8 мл рабочего раствора тромбина, прогревают его на водяной бане при 37 С в течение

2 мин и добавляют к нему 0,2 мн исследуемой дефибринированной адсорбированной.плазмы и немедленно включают секундомер. Ровно через 3 мин ин- 5п кубации этой смеси на водяной бане . при 37 С 0,2 мп ее переносят в пробирку с 0,3 мл рабочего раствора фибриногена, предварительно также прогретого в течение 1 мин при 37 С.

Немедленно включают второй секунцомер и регистрируют время свертывания. По калибровочной кривой находят процентное содержание AT III.

Построение калибровочной кривой.

Цитратную плазму, полученную у 10 здоровых людей, адсорбируют и дефибринируют по указанной методике, после чего все образцы смешивают в равных объемах в одной пробирке. Эту смесь разводят буфером Хихазлиса в

2,4,8 и 16 раз, чем достигается сни жение концентрации АТ III cooтветственно до 50", 25, 12,5 и 6,252.

По указанной методике определяют активность AT III каждого разведения в секундах (измерения проводятся трижды и при совпадении результатов берется их среднее арифметическое).

На кривой разведения по оси ординат откладывается десятичный логарифм времени свертывания в секундах, а по оси абсцисс — активность AT III в. процентах в соответствии с приготовленными разведениями.

Выработка режимов адссрбции. Проводится исследование влияния концентрации сорбента на степень удаления факторов свертывания (по протромбиновому времени) и активность AT III (по кривой, построенной на адсорбированной плазме) .

Данные приведены в табл, 1.

Установлено, чтс активность AT III стабилизируется при 5-ми --,:ной адсорб»п»и с сульфатом бария в концентрации 400 мг/мл. Дальнейшее увеличение концентрации сорбента не влияет на определяемую активность AT III.

Для исключения воз можног о влияния факторов свертывания, удаляемых сульфатом бария, на степень адсорбции гепарина используется адсорбированная плазма, в которой определяется тромбиновое время, а затем после гепаринизации проводится адсорбция.

В табл. 2 представлена зависимость между степенью гепари»»изации плазмы и концентрацией сорбента, достаточной для полного удаления гепарина (при

5-минут:ной адсорбции) .

Для определения,;":ÿ;àèìoäåéoòвия гепарина и факторов свертывания удаляемых сульфатом бария,. определяется активное b AT IIЕ (»»o Kpaвой, енной на адсорбированной плазме) при различнь»х степенях адсорбции в плазме с гепарином и без не" о (табл. 3)Установлено (табл. 3), что концентрация сульфата бария „рекомендуемая для адсорбции,, является достаточной

1464090 ности сгособа в рапии, проводят сульфатом бария

HB 1 мл II B 3 MhI

Т а бл и ца 1

Концентрация сор бента, мг /мл вр емя, с ность

AT III Ж

400

22

59

180, нет тыва ния

180, нет тывания

100 свер800 свер- 100

Контр ол ь ная плазма

Та блица 2

0,1

0,4

1,0

2,0

3,0

500

Та блица 3

Активность AT III Ж

Концентрация сорбента,мг/мп

Плазма гепаонтрольная плазма ри ни зир ова иная в концентрации

3 ед/мп

100

200

400

100

100

1000 для удаления факторов свертывания и гепарина в концентрации 3 ед/мл плазмы и составляет 900 мг/мл плазмы.

Пример 1. Больная А., 32 го5 да. ДиагH03: сепсис, двусторонняя септическая пневмония, ДВС-синдром.

В качестве базисной терапии ДВСсиццрома больной подкожно вводили гепарии в суточной дозе 20 тыс.ед.

Результаты лабораторного исследования системы гемостаза приведены в табл. 4.

Известным способом выявилась ложно высокая активность AT III, что 15 объясняется влиянием гепарина.

Выявленное предлагаемым способом снижение активности AT III явилось показанием для проведения коррекционно-заместительной терапии свежезамо- 20 роженной плазмой в дозе 600 мл.

Пример 2. Больная С., 37 лет.

Диагноз . сепсис, ДВС-синдром.

В кач еств е ба зис ной т ер алии ДВСсиндрома больной подкожно вводили ге-> парин в суточной дозе 25 тыс. ед.

Pезультаты лабораторного исследования системы гемостаза приведены в табл. 5.

Таким образом, несмотря на снижение активности AT III определяемое известным способом, данные цифры являются завышенными, а действительное снижение активности AT III, определяемое предлагаемым способом, является гораздо более глубоким.

Таким образом, при гепаринотерапии известный способ дает завышение результатов, тогда как результаты, полученные с помощью предлагаемого

40 способа, не зависят от присутствия в пла з ме г е пари на .

Формула изобретения ф

Способ определения активности антитромбина III в плазме крови, включающий обработку дефибринированной

1 плазмы зкзогенным тромбином с последующей оценкой активности анти,тромбина III по активности остаточ1 ного тромбина, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения точусловиях гепаринотеобработку плазмы в количестве 900 мг

Протромбиновое АктивКонцентРациЯ ге- Концентрация сорпари на, ед/мл бента, мг/мп

Не определяется

Не определяется

Не определяется

100

1464090

Та блица 4

Больная

Контроль

Тест

Активированное парциальное тромбопластиновое время, с

Этаноловый

Протаминсуль4атный

Количество тромбоцитов

Активность AT III, У.,по способу известному предлагаемому

40 48

Положительный Отрицательный

Положительный Отрицательный

151 ° 10 /л

100

Та блица 5 б

Контроль

Больная

Тест

Активированное парциальное тромбопластиновое врею, с

Этаноловый, Hpотаминсульфатный

Количество тромбоцитов

49

Положит ельньй

Положительный

О три ца т ел ь ный

Отрицат ельный

90 .10 /л

Активность AT III % по способу известному предлагаемому

100

Составитель Л. Потемкин

Редактор И.Горная Техред М.Дндык Корректор О, Кравцова

Заказ 819/48, Тираж 788, Подписное

ВНИИЛИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент",, r.Óæãoðîä, ул. Гагарина,101