Способ подготовки бактерий для электронно-микроскопического исследования

Способ подготовки бактерий для электронно-микроскопического исследования

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к микробиологии , в частности к методам электронной микроскопии бактерий.. Целью изобретения является сокращение длите 1ьности подготовки бактерий для электронной микроскопии. Фиксацию бактерий осуществляют в течение 5- 10 мин в смеси следующего состава, мас.%: глутаральдегвд 2,0-2,5; урвнилацетат 0,5-0,6; хлористьй кальций 0,11-0,12; ацетат-вероналовый буфер (рН 6J0-6,2)1 - остальное, затем в течение 50-55 мин после добаапения к указанной смеси 3-4%-ного водного раствора четырехокиси осмия в соотношении 1:1, пропитку проводят в трех сменах абсрлютного спирта и аралдита или пропиленодссида и эпона при их соотношении (1-3):(3-1) в течение 1,5-2 ч при 35-37°С и затем в смоле в течение 1,5-2 ч в вакууме 133,32 х X Па при 35-37 С. После этого в течение 14-16 ч проводят пол1меризацию при 70-90°С. с (Л

СОЮЗ С08ЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51) 4 С 01 Н 1/28

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H A BTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Ацетат-вероналовый буфер (рН 6,0) ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ

IlQ ИЗОБРЕТЕНИЯМ И OTHPbfTHRM

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4277199/28-13 ! (22) 06.07.87 (46) 15.03.89. Бюл. ¹ 10 (7 1) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии (72) В,Н. Герасимов, С.Б.Лущиков и Н.M.Èñàíãàëèía (53) 578.6 (088.8) (56) Ryter А. efal. Etude an microscope electronique de plasmas contenant de Uacide desoxyribonucleique.—

Z.iVaturforch, 1958, v.138, р.597609.

Daniel J.W. and jarlfors U. Plasmodia1 ultrastructure of the myxpmycete. Physarum polycephalum. — Tissue and cell, 1972, ч. 4(1), р. 1536. (54) СПОСОБ ПОДГОТОВКИ БАКТЕРИЙ ДЛЯ

ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ (57) Изобретение относится к микро1

Изобретение относится к микробиологии, в частности к методам электронной микроскопии бактерий.

Цель изобретения — сокращение длительности подготовки бактерий для электронной микроскопии.

Пример 1. Бактерии Escheri-..

chia coli К- l2, выращенные на плотной среде, петлей (3-4 петли) переносят в пробирку с фиксирующей смасью следующего состава, мас.%:

Глутаральдегид 2

Уранилацетат 0,5

Хлористый кальций 0,11

„„SU„„f465740 А1 биологии, в частности к методам электронной микроскопии бактер .. Целью изобретения является сокращение длительности подготовки бактерий для электронной микроскопии. Фиксацию бактерий осуществляют в течение 510 мин в смеси следующего состава, мас.%: глутаральдегид 2,0-2,5; уренилацетат 0,5-0,6; хлористый кальций

О, 11-0, 12; ацетат-вероналовый буфер (рН 6,0-6,2) — остальное, затем в течение 50-55 мин после добавления к указанной смеси 3-4%-ного водного раствора четырехокиси осмия в соотношении 1:f, пропитку проводят в трех сменах абсрлютного спирта и арал- а

Ф дита или пропиленоксида и эпона при ин ооотношенни (1-3):(3-!) н течение Q)

1,5-2 ч при 35-37 С и затем в смоле в течение 1,5-2 ч в вакууме 133,32 х C х 10 Па при 35-37 С. После этого в течение 14-16 ч проводят полимеризацию при 70-90 С. ) 4

Остальное

; и фиксируют в течение 5 мин при ком-. натной температуре. Затем к суспензия добавляют 3%-ный водный раствор четырехокиси осмия в соотношении

1:1 и дофиксируют в течение 55 мин при комнатной температуре. Суспензию 1о клеток центрифугируют и осадок дегидратируют в градиенте концентрации этилового спирта: (50% 10 мин) 70%

10 мин; 80% 10 мин; 90% 10 мине 95%

10 мин; 100% (абсолютный этиловый з 1465740 спирт) 20 мин (3 смены). Пропитывают в 3 мл смеси, состоящей из следующих образцы н трех сменах абсолютного компонентов, мас. : э тилового спирта и аралдита н соото

Глутаральдегид 2 ношениях 3: 1 1: 1, 1; 3 при 37 С по Уранилацетат

Ф

° ф ° у °

0 11

1,5 ч в каждой, затем переносят в Хлористыи кальции

Э чистый аралдит и выдержинают н вакуу- Ацетат-вероналовый ь1е (10 т рр) 1,5 ч при 37 С. За- буфер (pH 6,0) Остальное ючают образцы в аралдит и полимери- и фиксируют в течение 7 мин при комуют при 90 С в течение 14 ч. натной температуре.

Дофиксируют и дегидратируют анаПредлагаемый способ фиксации и логично примеру 1. Дегидратированные репарирования бактерий позволяет клетки выдерживают в пропиленоксиде течение 23 ч подготовить клетки к 10 мин при комнатной температуре. лектронно-микроскопическим исследо- 1g Пропитывают в трех сменах пропиленоксида и эпона при их соотношениях

Изучение срезон бактерий E.Coli 3:1, 1:1, 1:3 при 37 С по 1,5 ч в кажэлектронной микроскопе показало, дой. Затем образцы переносят в эпон то тонкая структура клеток качест- и выдерживают в вакууме (10 рр)

0 "то енно сохранена. На срезах выявляются 2р 1,5 ч при 37 С, Заключают образцы в се ультраструктурные элементы клет- эпон и полимериэуют при 70 С в течение 15 ч.

Фиксацию и препарирование бактеПример 2. Бактерии Е.Coli рий для электронно-микроскопических

-12, выращенные на плотной среде, 2Б исследований проводят в течение 24 ч. етлей переносят в 3 мл фиксирующей Способ обеспечивает сохранность улн меси, состоящей из следующих компо- траструктуры бактерий.

Hp и м е р 4. Бактерии E Coli

Глутаральдегид К-12 фиксируют, дофиксируют, дегидУранилацетат Зр ратируют аналогично примеру 2.ПропиХлористый кальций тывают в трех сменах пропиленоксида

Ацетат-вероналовый и эпона в соотношениях 3: 1, 1:1, 1:3 буфер (рН 6,2) Остальное при 37 С по 2 ч в каждой. Затем и фиксируют в течение 10 мин при ком- образцы переносят в эпон и выдержи1 < -з> натной температуре. Затем к суспен- нают в вакууме (10 торр) 2 ч

35 о

,зии добавляют 4 -ный водный раствор при 37 С. Заключают образцы в эпок четырехокиси осмия в соотношении 1:1 и полимеризуют при 90 С в течение и дофиксируют в течение 50 мин при 14 ч. комнатной температуре. Дегидратацию Исследование в электронном микрообразцов проводят аналогично примеру 4р скопе ультратонких срезов Е. Со1ь по1. Пропитывают клетки н трех сменах казало, что тонкая структура качестабсолютного этилового спирта и арал- венно сохранена. дита в соотнощениях 3: 1,, 1: 1, 1:3 На фиксацию и препарирование бак при 35 С по 2 ч в каждой. Затем об- терий затрачивают 23 ч. раэцы переносят в чистый аралдит и 4 П р н м е р 5. Бактерии E.Coli выдерживают в вакууме (10 торр) К-. 12 фиксируют, дофиксируют, дегид2 ч при 35 С. Заключают образцы в ратируют, пропитывают и заключают аралдит и полимеризуют при 80 С 16 ч. аналогично примерам 1-4 ° ПолимеризаПредлагаемый способ позволяет за цию образцов проводят при 65 С в

27 ч подготовить бактерии к ультра- Бр течение 15 ч. структурным исследованиям. Было обнаружено, что полимеризао

Тонкая структура клеток Е.Coli, ция образцов при 65 С н течение 15 ч препарированных с помощью этого спо- является недостаточной, блоки имеют. соба, качественно сохранена. мягкую консистенцию и плохо режутся

Пример 3. Используют бакте- >> на ультрамикротоме. рии 18-часовой культуры К-12, выра- 6. Бактерии Bacillus щенные на жидкой питательной среде. thuring:iensis шт,-52, выращеннь1е на

Примерно 2-3 мл суспензии клеток плотной среде 72 ч при 37 С, фиксицентрифугируют и осадок суспензируют руют, дофиксируют, дегидратируют, 2,5

0,6

0„12

65740 б ранена. На срезах отчетливо выявляются все ультраструктурные элементы споровых клеток.

Составитель И.Тареева

Техред Л.Сердюкова Корректор М.Васильева

Редактор А.Orap

Заказ 936/42 Тираж 788 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Ужгород, ул. Гагарина, 101

5 14 пропитывают, заключают и полимеризуют аналогично примеру 1.

Электронно-микроскопическое изучение ультратонких срезов спор Вас.

thuringiensis показало, что тонкая структура споровых клеток качественно сохранена. Выявляются все ультраструктурные элементы спор.

Пример 7. Бактерии Вас.

thuringiensis шт.-52, выращенные на жидкой среде, фиксируют, дофиксируют, дегидратируют, пропитывают, полимвризуют аналогично примеру 3.

Ультраструктура споровых клеток

Вас. thuringiensis, фиксированных и препарированных по предлагаемой методике, качественно сохранена.

Пример 8. Бактерии Bacillus врр. шт.-18, выращенные на плотной среде в течение 48 ч при 37 С, фиксируют, дофиксируют, дегидратируют, пропитывают, заключают и полимеризуют аналогично примеру 2.

Ультраструктура вегвтативных кле- ток, проспор и спор Вас. spp. шт.-18 качественно сохраняется.

П. р и м е р 9. Бактериальные клетки Bacillus spp. шт.-18 фиксируют, дофиксируют, дегидратируют, пропитывают, заключают и полимеризуют аналогично примеру 4 °

Структура споровых клеток Вас, spp. шт.-18,препарированных по предлагаемому способу, качественно сох5

Формула изобретения

Способ подготовки бактерий для электронно-микроскопического исследования, включающий фиксацию, дегидратацию, пропитку и заключение в эпоксидные смолы с последуннцей полимвриэацией, отличающийся тем, что, с целью сокращения длительности подготовки, фиксацию осуществляют з две стадии — вначале в течение 5-!О мин 8 смеси следуницвго состава, мас.й:

Глутаральдегид 2,0-2 5

20 Уранилацетат 0 ° 5-0 6

Хлористый кальций О, 11-0, 12

Ацетат-вероналовый буфер рН 6,0-6,2 Остальное а затем в течение 50-55 мин после

25 добавления к указанной смеси 3-4Хного водного раствора чвтырвхокиси осмия в соотношении I:1, пропитку проводят в трех сменах абсолютного спирта и аралдита или пропилвно30 ксида и эпона при их соотношении

1-3:3-1 в течение 1,5-2 ч при 3537 С и затем в смоле в течение 1,52 ч в вакууме 133,32 "!О Па при

35-37 С, а полимеризацию осущвствляI о з ют в течение !4-16 ч при 70-90 С.