Способ определения активности глутатионпероксидазы в эритроцитах крови

Способ определения активности глутатионпероксидазы в эритроцитах крови

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для целей диагностики. Для определения активности глутатионпероксидазы используют среду инкубации, содержащую: трис/гидроксиметил/аминометан/Трис/-HCI буфер 100 ммоль, рН 8,5

этилендиаминтетраацетат натрия (ЭДТА) 4,0 ммоль

азид натрия 10,0 ммоль

глутатион 4,0 ммоль

гидроперекись третичного бутила. При этом колориметрически измеряют скорость окисления глутатиона с помощью 5,5-дитиобис(2-нитробензойной) кислоты при 412 нм. Способ позволяет определять активность глутатионпероксидазы цельной крови, эритроцитов и тромбоцитов. 1 табл., 3 ил.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) (5ц 4 6 01 М 33/68

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А STOP CHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР (21) 4011600/28-14 (22) 13.01. 86 (46) 07.04.89. Бюл. У 13 (71) Минский государственный медицинский институт (72) В.М,Моин (53) б!2.015 (088.8) (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ГЛУТАТИОНПЕРОКСИДАЭЫ В ЭРИТРОЦИТАХ . КРОВИ (57) Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для целей диагностики. Для определе-. ния активности глутатионпероксидазы

Изобретение относится к биологической химии и медицине и может использоваться для определения активности ферментов крови.

Цель изобретения — разработка способа определения активности глутатионпероксидазы в эритроцитах крови.

Способ осуществляется следующим образом..

Определение активности глутатионпероксидазы в эритроцитах.

За меру активности глутатионпероксидазы принимают скорость окисления глутатиона в присутствии гидроперекиси третичного бутила. Концентрацию глутатиона до и после инкуба,,ции в предлагаемой среде с помощью

5,5-дитиобис(2-нитробензойной) кис лоты (ДТНБК) определяют колориметри,чески. Количество образующегося продукта — тионитрофенильного аниона используют среду инкубации, содержащую: трис(гидроксиметил) аминометан (трис)-HCl буфер 00 ммоль, рН 8,5; этилендиаминтетраацетат натрия (ЭДТА) 4,0 ммоль; азид натрия

10,0 ммоль; глутатион 4,0 мысль;гидроперекись третичного бутила, При этом колориметрически измеряют скорость окисления глутатиона с помощью

5, 5-дитиобис(2-нитробензойной ) кислоты при 412 нм, Способ позволяет определять актив но сть глута тионп ероксидазы цельной крови, эритроцитов и тромбоцитов. 1 табл,, 3 ил. (ТНФА) — прямо пропорционально количеству сульфогидрильных групп глутатиона, прореагировавших с ДТНБК.

Реактивы: трис-HCl буфер 100 ммоль, рН 8,5, содержащий 4,8 ммоль ЭДТА, 12 ммоль азида натрия и 4,8 ммоль фЬ глутатиона (о); гидроперекись третичного бутила 20 ммоль/л (8 ) три- ы хлоруксусная кислота (ТХУ) 200 г/л (Ь); ДТНБК на метаноле !О ммоль/л (2); трис-НС1 буфер 100 ммоль/л, рН 8,0 ($). !.В качестве антикоагулянта используют ЭДТА (! мг на 1 мл крови).

Эритроциты промывают холодным изотоническим раствором хлорида натрия (9 г/л) с рН 7,4, центрифугируют

30 мин при 4000 об/мин и 4 С, гемолизируют равным объемом дистиллированной воды.и повторным замораживанием и оттаиванием, Гемолизат разво147) 134 дят водой до концентрации по гемоглобину ) 0 г/л, Ход исследования: 100 мкл гемолизата преинкубируют с 830 мкл реактио ва а 10 мин при 37 С, добавляют

70 мкл реактива E и инкубируют точно 5 мин. Реакцию останавливают,цобавлением 200 мкл реактива 5,осажденные белки удаляют центрифугированием. 100 мкл надосадочной жидкости вносят в 9,9 мл реактива ) и добавляют 100 мкл реактива и . Фотометрируют при 412 нм, толщина оптического слоя кюветы 10 мм, Контрольная проба отличается тем, что гемолизат вносят в инкубационную среду непосредственно перед осаждением белков реактивом

С учетом разведения гемолизата и коэффициента молярной экстинкции

ТНФА при 412 нм — 11400 рассчитывают активность глутатионпероксидазы в микромолях израсходованного в реакции субстрата (глутатиона ) по форму= мкмоль/мин/1 г гемоглобина, где

ОП вЂ” оптическая плотность, На фиг,1 показана зависимость активности глутатионпероксидазы (ГП) эритроцитов от концентрации гидроперекиси третичного бутила в среде.

Из представленных данных следует, что насыщение фермента ГП эритроцитов этим субстратом достигается при концентрации его в среде 1,4 ммоль, На фиг.2 показана скорость окисления глутатиона в предлагаемой среде в присутствии глутатионпероксидазы донорской крови (эритроцитов),Из представленных данных следует, что линейная зависимость между скоростью окисления глутатиона (по разнице оптических плотностей (ОП) контрольной и опытной проб) и временем инкубапии в предлагаемой среде сохраняется в пределах не менее б мин.

На фиг. 3 показана зависимость между активностью ГП эритроцитов и количеством фермента в пробе (относительно количества гемоглобина гемолизата), измеренная в предлагаемой среде. Из представленных данных следует, что эта линейная зависи.мость сохраняется в широком диапазоне активности ГП, по меньшей мере до 1000 мкмоль/мин/1г гемоглобина.

)О

Предлаrаемый способ специфичен.

В таблице суммированы результаты проверки специфичности способа определения активности ГП эритроцитов в присутствии ингибитора ГП (монойод-. ацетат), который полностью подавляет ферментативную активность (на 98,8+

+ 0,8 %); обработка гемолизата трансформируюшим раствором практически не влияет на результаты анализа: подавление потенциальной псевдопероксидазной активности гемоглобина трансформацией последнего в цианметгемоглобин статистически недостовер25 но (0347+ ) ьо)%)

Предлагаемыи способ может быть использован при определении активности ГП цельной крови и эритроцитов.

ЗО

Формула изобретения

Способ определения активности глутатионпероксидазы в эритроцитах крови, включающий помещение их в среду инкубации, содержащую 100 ммоль трис -НС1 рН 8,5, 4 ммоль этилендиаМинтетраацетата натрия, 10,0 ммоль рН 8,5, 4 ммоль этилендиаминтетрааце40 тата натрия, 10,0 ммоль азида натрия, 4 ммоль глутатиона, добавление к смеси 1,4 ммоль гидроперекиси третичного бутила, обработку пробы трихлоруксусной кислотой, удаление белково45 го осадка, добавление к надосадочной жидкости 5,5-ди-тиобис(2-нитробензойной) кислоты с последующим спектрофотометрическим измерением оптической плотности при 41 2 нм.

1471134

Гемолиэат

Донор обработанный монойодацетатом нативный обработанный трансформирующим раствором

Ингибирование,7

АктивАктивингибирование

Х ность, мкМ/мин/

/мл ность 1 мкМ/мин/

/мл

Б-я

К- о

Б — в

С вЂ” в

К вЂ” й

К вЂ” а

К вЂ” я

ГП маколь|мин!1 г аеиоалобина

7УО

770

07 14 27 28

Гцдродерекцс лрет -бутило, гтоВь

4Й/8 1

ОП

О,.УОО

0 100

° У 4 5 8 7 8 У Ункубацио иихф

Quz.Г

282,8

296,9

204,6

132,4

248,7

204,6

68,?

280,0

298,0

204,0

138,5

240,0

204,0

66,0

0,99

-0,37

0,29

-4,60

3 50

0,29

3,20

2,0

О

О

4,0

99,3

94,0

98,0

100

1471134

ГПмиоль кии11 г аеио лобииа

ЕОО

ФОО

М0

ggzlg 8>70 Z,Á>10 ГЕЕНО © Ц > щи.3

Составитель Д,Попов

Редактор Е.Папп Техред А.Кравчук Корректор М;Пожо

Заказ 1603/47 Тираж 788 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

1 13035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãîðîä, ул. Гагарина,101