Способ иммобилизации ферментов

Способ иммобилизации ферментов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и может найти применение в медицинской, химической и микробиологической пром. Целью изобретения является повышение гидродинамической устойчивости прививаемых ферментов, упрощение и ускорение процесса. Согласно способу титановую губку, промытую водой и высушенную при 100°С, активируют путем обработки перекисью водорода с концентрацией 30-35% при соотношении титановая губка: перекись водорода 1:/3-5/ в течение 45 мин при 55-67°С, после чего на активированный таким образом носитель иммобилизуют фермент известным способом. 1 з.п.ф-лы, 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

А1

„„SU„„1472505

1 11 4 С 12 N 11/14

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ДBTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ титана.

Титановая губка имеет высокую механическую прочность, большую удельную поверхность, составляющую

0,06-0,11 м /г, и невысокую насы9 щенную массу в пределах 0,7-1,1 г/см .

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

flO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР (21) 4269855/31-13 (22) 29,04,87 (46) 15,04,89, Бюл, N- 14 (71) Одесский технологический институт пищевой промышленности им. M.Â.Ëoìoíoñîâà (72) В .Н .Голубев, Ю .В .Метешкип, Е.Н.Кананыхина, В.П.Антонюк и М.И.Кошель (53) 663.18(088.8) (56) Иммобилизованные ферменты./Под ред, Березина И,В., Антонова В,К,, Мартинека К. Изд-во МГУ, 1976, Авторское свидетельство СССР

N- 536192, кл. А 61 К 37/48, 1975 °

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к технологии биохимического превращения органических веществ растительного или животного происхождения, и может найти применение в медицинской, химической и микробиологической промышленности.

Цель изобретения — повышение гидродинамической устойчивости прививаемых ферментов, упрощение и ускорение процесса иммобилизации.

Способ осуществляется следующим образом, К промытой в дистиллированной воде и высушенной титановой губке приливают перекись водорода с концентрацией

30-35Х при соотношении титановая губка.: перекись водорода равном 1:(3-5) (54) СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ ФЕРМЕНТОВ (57) Изобретение относится к биотехнологии и может найти применение в медицинской, химической и микробиологической промышленности. Целью изобретения является повышение гидродинамической устойчивости прививаемых ферментов, упрощение и ускорение процесса. Согласно способу титановую губку, промытую водой и высушенную при 100 С, активируют путем обработо ки перекисью водорода с концентрацией 30-357 при соотношении титановая губка: перекись водорода 1; (3-5) в.течение 45 мин при 55-67 С, после чего на активированный таким образом носитель иммобилизуют фермент известным способом. 1 з.п. ф-лы. 1 табл.

2 соответственно. Смесь термостатируют при 55-67 С при встряхивании в течение 45 мин, затем промывают дистиллированной водой до нейтральной реакции и сушат при 150 С в течение 1 ч.

Активированную таким образом титаноо вую губку охлаждают до 0- С, после чего иммобилизуют на ней фермент, Титановая губка является побочным продуктом при получении чистого титана методом магнийтермического восстановления четыреххлористого з 147250

Пример 1. Получение активированного носителя, К 5 r промытой в дистиллированной воде и высушенной при 100 С титановой губки добавляют 15 мл перекиси водорода с концентрацией 30-35Х.

Смесь термостатируют при 55 С при встряхивании в течение 45 мин, затем промывают дистиллированной водой до нейтральной реакции и сушат IIpH

150 С в течение 1 ч. Активированную, таким образом титановую губку охлажо дают до 0 С и используют для иммобилизации ферментов, 1S

Пример 2. Иммобилизация пепсина.

К 2 г титановой губки, активированной по примеру 1, приливают 10 мл

0,57.-ного раствора пепсина в 0,1 М 20 ацетатном буфере при рН 4,0. Смесь. взбалтывают на механической качалке о в течение 1 ч при 4 С и выдерживают в течение 10 ч. Титановую губку с иммобилиэованными ферментами промы- 25 вают от несвязанного фермента 490 мл дистиллированной воды, Получают иммобилизованный препарат с активностью

1800 ед/г, т.е. 627. активности нативного фермента, 30

Пример 3. Иммобилизация пектиназы иэ Aspergillus niger, К 2 г титановой губки, активиро.ванной по примеру 1, приливают 5 мл

3Е-ного раствора пектиназы в 0,1 M ацетатном буфере при рН 4,0. Смесь

35 тщательно перемешивают и взбалтывают на механической качалке 2 ч. при о

0 С и оставляют на 10 ч. Губку промы вают 100 мл дистиллированной воды до 0 нейтральной реакции. Получают иммобилизованный препарат с активностью фермента 83,2 ед/г, что составляет

90 от активности нативного фермента.

Пример 4. Иммобилизация про- 45 теазы из Aspergillus oryzae.

К 5 г титановой губки, активированной по примеру 1, приливают 10 мл

0,57-ного раствора проторизина в.

0,1 N универсальном буферном растворе при рН 4 (О,! М борной кислоты, 0 1 Yi фосфорной кислоты, 0,1 N уксусной кислоты в 1 М щелочи). Смесь тщательно перемешивают и взбалтывают

6 на механической качалке 2 ч при 2 С и оставляют при этой температуре на

10 ч, Титановую губку промывают

100 мл дистиллированной воды до нейтральной среды. Получают иммобилизованный препарат с активностью фермента 132 ед/г, что составляет 66Х от активности титанативного фермента.

Пример 5, Иммобилизация суспензий клеток Е.coli.

В качестве ферментативно активно— го материала используют суспензию клеток Е.coli с аспартаэной активностью. Клетки Е.coli отделяют из культуральной среды и промывают дистиллированной водой с последующим центрифугированием в течение 10 мин, К 2 r титановой губки, активирован— ной по примеру 1, приливают 10 мл суспензии клеток Е.coli. Смесь охо лаждают до 6-8 С, приливают 9 мл

О, 1 М фосфатного буфера при рН 8, О, Смесь тщательно перемешивают и взбалтывают на механической качалке 2 ч при 4 С и оставляеют на 10 ч. Титановую губку с иммобилизованной суспензией клеток промывают на фильтре от несвязанных клеток 0,1 М водным раствором хлористого натрия до ис- . чезновения светопоглощения при

280 нм в промывных водах и 0,1 М ацетатном буфере при рН 4,5 до отсутствия ионов хлора, Получают препарат с общей аспартаэной активностью 69520 ед, что составляет 907. от исходной общей аспартазной активности внесенных свободных клеток. II р и м е р 6. Получение активи— рованного носителя фермента.

К 5 г промытой в дистиллированной о воде, а затем высушенной при 100 С титановой губки добавляют 25 мл концентрированной гидроперекиси. Смесь о термостатируют при 67 С при встряхивании в течение 45 мин, затем промывают дистиллированной водой до нейто ральной реакции и сушат при 150 С в течение 1 ч, Активированную таким образом титановую губку охлаждают до

О С. Подготовленную активированную титановую губку используют для иммобилизации на ней ферментов.

Пример 7, Иммобилизация пепт сина.

К 2 r титановой губки, активированной по примеру 6, приливают 10мл

0,5%-ного раствора пепсина в 0,1 М ацетатном буфере при рН 4,0. Смесь взбалтывают на механической качалке в течение 1 ч при 4 С и выдерживают в течение 10 ч, Титановую губку с иммента.

Фермент СоотноОбщее Активвремя ность ферактива- мента, ед/г

Гидролитическая устойчивость

Темпера- Время актура, С тивации носиСпособ по примерам шение

Ti: Н,С, теля, мин ции

1371

104

112

1 ч.45

1 ч.30

2 ч.

1 ч.45:

6

42

60, 70

1:2

1:6

1:2

1:6

11

12

13

Пеп сии

Пепсин

Протеаза

Протеаза, 5 14 мобилизованными ферментами промывают от несвязанного фермента 490 мл дистиллированной воды, Получают иммобилизованный препарат с активностью

1870 ед/г, т.е. 64,4% активности нативного препарата.

Пример 8, Иммобилизация протеазы из Aspergillus oryzae, К 5 r титановой губки, активированной по примеру 6, приливают 10 мл

0,57-ного раствора проторизина в

0 1 M универсальном буфере растворе при рН 4, Смесь тщательно перемешивают и взбалтывают на механической о качалке 2 ч при 2 С и оставляют при этой температуре на 10 ч. Титановую губку промывают 100 мл дистиллированной воды до нейтральной среды. Получают иммобилизованный препарат с активностью фермента 140 ед/г, что составляет 707 от активности нативного фермента.

Пример 9. Получение активированного носителя фермента.

К 5 г промытой в дистиллированной воде, а затем высушенной при 100 С титановой губки добавляют 20 мл концентрированной гидроперекиси. Смесь

D термостатируют при 60 С при встряхивании в течение 45 мин затем промывают дистиллированной водой до нейт о ральной реакции и сушат при 150 С в течение 1 ч. Активированную таким образом титановую губку охлаждают до, о

0 С. Подготовленную активированную титановую губку используют для иммобилизации на ней ферментов.

Пример 10. Иммобилизация пепсина.

К 2 г титановой губки, активированной по примеру 9, приливают 10мл

0,5Х-ного раствора пепсина в 0,1 M ацетатном буфере при рН 4,0. Смесь взбалтывают на механической качалке

6 о в течение 1 ч при 4 С и выдерживают в течение 10 ч. Титановую губку с иммобилизованными ферментами проМыва— ют от несвязанного фермента 490 мл дистиллированной воды. Получают иммобилизованный препарат с активностью

1780 ед/г, т.е. 61,57. активности нативного фермента.

Пример ы 11 — 18. Способ осу". ществляют аналогично, но при различном соотношении титановой губки и гидроперекиси при активации носителя.

Результаты указаны в таблице.

Как видно из таблицы при выходе

sa режимы соотношения титановая

20 губка:перекись водорода снижается активность иммобилизованного ферФормула изобретения

1, Способ иммобилизации ферментов, предусматривающий активацию . носителя на основе титана и последующее связывание ферментов с активированным. носителем, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью повышения гидродинамической устойчивости прививаемых ферментов, упрощения и ускорения процесса, в качестве носителя используют титановую губку, а активацию осуществляют путем обработки 30-35Х-ной перекисью водорода при соотношении титановая губка : перекись водорода равном

40 1:(3-5) соответственно и температуре 55-67 С.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а.юшийся тем, что обработку перекисью водорода ведут в течение

45 45 мин .

1472505

Продолжение таблицы

7 8

Составитель А.Семенов

Редактор И.Сегляник Техред J1 Сердюкова Корректор В.Романенко

Заказ 1674/28 Тираж 501 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,101

16

17

Пектиназа - 1 2.

Пектиназа 1: 6 .

Е.coli 1:2

Е.coli 1:6

90 80

13

2 ч.30

2 ч.

1.ч.45

1 ч. 30

67 70

47900