Способ определения активаторов плазминогена

Способ определения активаторов плазминогена

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к прикладной биохимии и может быть использовано в производстве препаратов активаторов плазминогена, а также при лабораторном изучении состояния гемостаза и фибринолиза. Цель изобретения заключается в повышении точности способа. Способ состоит в том, что готовят две фибриновые пластины путем смешивания раствора человеческого фибриногена, содержащего плазминоген, и раствора тромбина, выдерживания их при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем одну из пластин для инактивации плазминогена подвергают ультрафиолетовому облучению до энергетической экспозиции 1,4-2,6 Дж/см<SP POS="POST">2</SP>, при этом расстояние между пластиной и источником излучения устанавливают равным 35-45 см. Вторую пластину облучению не подвергают. На обе пластины наносят раствор исследуемого активатора плазминогена и инкубируют в термостате при 37°С. По окончании инкубации измеряют площадь зон лизиса на обеих пластинах (мм<SP POS="POST">2</SP>) и определяют активаторы плазминогена, вычитая из площади зоны фибринолиза на необлученной пластине площадь зон лизиса на облученной пластине. 1 ил. 3 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

15ц 4 С 12 Ч 1/56

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АBTOPCHQMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЬГГИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4100633/28-13 (22) 28.07.86 (46) 15.04.89. Бюл. Н - 14 (71) Белорусский научно †исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии (72) B.Н.Никандров и Н.С.Пыжова (53) .663,15(088.8)

1 (56) 4оЫ К.С;, Sinio L., Robbins К.С;

Methods for stuting fibrinolytic

pathway components in human plasma, Thromb. Res, 1982, 27, 523-535.

Баскова И,П. Практикум по физиологической химии. И.: Изд-во ИГУ, с. 89-91. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВАТОРОВ

ПЛАЗМИНОГЕНА (57) Изобретение относится к прикладной биохимии и может быть использовано в производстве препаратов активаторов плазминогена, а также при лабораторном изучении состояния гемостаза и фибринолиза. Цель изобретения заключается в повышении точности

Изобретение относится к прикладной биохимии и может быть использовано при лабораторном изучении состояния гемостаза и фибринолиза, а также при производстве препаратов активаторов плазминогена.

Цель изобретения — повышение точности способа.

На чертеже представлены зоны лизиса.

Способ осуществляется следующим образом.

В двух чашках Петри готовят фибриновые пластины путем смешивания в

„„SU„„1472508 А1 способа, Способ состоит в том, что готовят две фибриновые пластины путем смешивания раствора человеческого фибриногена, содержащего плазминоген, и раствора тромбина, выдерживания их при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем одну из пластин для инактивации плазминогена подвергают ультрафиолетовому облучению до энергетической экспозиции 1,4

2,6 Дж/см, при этом расстояние между пластиной и источником излучения устанавливают равным 35-45 см, Вторую пластину облучению не подвергают.

На обе пластины наносят раствор исследуемого активатора плазминогена о и инкубируют в термостате при 37 С.

По окончании инкубации измеряют площадь зон лизиса на обеих пластинах (мм ) и определяют активаторы плазминогена, вычитая из площади зоны фибринолиза на необлученной пластине площадь зон лизиса на облученной пластине. 1 ил, 3 табл.

2 расчете на 1 чашку 9 мл 0,3Е-ного раствора, содержащего плазминоген человеческого фибриногена на 0,857ном растворе хлорида натрия и 0,2 мл тромбина (400-800 ед), выдерживания пластин при комнатной температуре в течение 30 мин для формирования фибрина инактивации плазминогена в одной иэ пластин облучением фибриновой пластины ультрафиолетовыми лучами до экспозиции 1,4-2,6 Дж/см, при этом расстояние между пластиной и источником излучения устанавливают равным 35-45 см.

1472508 рован, Стрептокиназа — истинный активатор плазминогена и действие ее проявляется только на плазминоген. Лонголитин — протеиназа, проявляющая свойства и активатора плазминогена ,ч фибринолитической протеиназы. В случае стрептокиназы и лонголитина ,активаторная активность равна соответственно 412 и 88 мм

50

При ультрафиолетовом облучении в заданном режиме избирательно инактивируется иммобилизованный на фибрине плазминоген, тогда как свойства фибринового геля полностью сохраняются, На необлученную и облученную пластину. наносят-по 0,03 мл раствора исследуемого активатора плазминогена и инкубируют их в термостате при 10

37 С в течение 20 ч. Затем измеряют площадь зон лизиса на обеих пластинах и определяют активаторы плазминогена, вычитая из площади зоны лизиса фибрина на необлученной пласти- 15 не площадь зоны на облученной пластине.

Пример 1, В 2 чашках Петри готовят фибриновые пластины, смешивая в расчете на 1 чашку 9 мл О,ЗЖ вЂ но 20 раствора, содержащего плазминоген человеческого фибриногена на 0,85Х-ном растворе хлорида натрия и 0,2 мл раствора тромбина (400 ед). Пластины выдерживают при комнатной температуре 25

30 мин для формирования фибрина, Одну из пластин подвергают ультрафиолетовому облучению с помощью облучателя ртутно-кварцевого настольного

ОКН-ll при 20 С в течение 10 мин под 30 а углом 90 к плоскости пластины на расстоянии 35 см от нее, Затем .на обе пластины наносят по 0,03 мл раствора стрептокиназы (500 ME) и по

0,03 мл раствора лонголитина и инкубируют их в термостате при 37 С в течение 20 ч и определяют площадь зон лизиса. Затем вычисляют разность площади зон лизиса на необлученной пластине и площади зон лизиса на об- 40 лученной пластине.

Лизис облученной ультрафиолетовыми лучами и необлученной фибриновых пластин стрептокиназной и лонголитином (n=5) представлен в табл.1. 45

Как видно из табл.1, стрептокиназа лизирует лишь фибрин необлученной пластины. Это доказывает, что в облу с ченной пластине плазминоген инактивиПример 2. В 2 чашках Петри готовят фибриновые пластины аналогичным примеру 1 образом. Пластины выдерживают при комнатной температуре

30 мин для формирования фибрина. Од— ну из пластин подвергают ультразвуковому облучению с помощью облучателя ртутно-кварцевого настольного

ОКН-11 при 22 С в течение 20 мин под углом 90 к плоскости пластины на расстоянии 40 см от нее, Затем на обе пластины наносят по 0 03 мл раствора стрептокиназы и по 0,03 мл раствора лонголитина. Далее способ выполняют аналогично примеру 1.

Результаты определения активаторов плазминогена по предлагаемому и известному способам представлены в табл,2.

Как видно из табл,2. изобретение позволяет повысить точность способа так как в этом случае не занижены показатели фибринолитической активности на пластинах с инактивированным плазминогеном.

Как видно из чертежа,при определении лонголитина на пластинах с инактивированным плазминогеном по предлагаемому способу зоны лизиса имеют ровные края (а), тогда как при определении по известному способу края зон неровные, форма — неправильная (б), что снижает точность определения активаторов.

Пример 3. В 8 чашках Петри готовят фибриновые пластины аналогичным примеру 1 образом, Все пластины выдерживают при комнатной температуре 30 мин для формирования фибрина. Затем 4 пластины подвергают о ультрафиолетовому облучению при 25 С о под углом 90 к плоскости пластины при следующих режимах: 1 — 5 мин, расстояние 35 см; 2 - 10 мин, расстояние 35 см; 3 — 20 мин, расстояние

40 см," 4 — 30 мин, расстояние 45 см.

Затем на все 8 пластин наносят по

0,03 мл раствора стрептокиназы. Да-. лее способ выполняют аналогично примеру 1. Результаты определения активаторов плазминогена (стрептокиназы, 500 NE, n=5) представлены в табл.3.

Как видно из табл,З, экспозиция менее 1,4 Дж/см не обеспечивает пол2 ную инактивацию плазминогена в пласт тине, Экспозиция более 2,6 Дж/см вызывает видимые изменения фибринового

1472508 6 пластине имеют ровные края и приближаются по форме к окружности, что обеспечивает высокую точность определения площади зон лизиса.

Таблица 1

Активатор

Стрептоки- наза

Лонголитин

412+20

220+13

132+ 5

Таблица 2

1звестный способ

Площадь зон фибринолиза, мм

Площадь зон фибринолиза, мм . актиоблученной необлученной актипрогретой непрогретой пласваторная акватор.ная ак пластиплас" тины пластины тивность тины ны тивность

Степрокиназа

Лонголи412

412 412 -20 0

412+20 - 0

220+13 132+5 88 220+13 103+20 117 тин геля. Избранное расстояние 35-45 см от плоскости пластины обусловлено тем, что при уменьшении расстояния менее 35 см происходит заметный разо грев .пластины.

Таким образом, для выполнения способа необходимо облучение ультрафиолетовыми лучами одной из фибриновых пластин до экспозиции 1,4-2,6 Дж/см

2 при этом источник устанавливают на расстоянии 35-45 см.

Пример 4. При облучении пластины свойства фибринового геля полностью сохраняются, что подтверж- 15 дается следующими данными. 9 мл О,ЗЖного раствора человеческого фибриногена, содержащего плазминоген, на

0,857.-ном растворе хлорида натрия, облучали облучателем ртутно-кварце- 20 о вым настольником ОКН-11 при 20 С в о течение 20 мин под углом 90 к плоскости поверхности раствора на расстоянии 35 см от нее. Затем к облученному раствору добавили 0,2 мл раствора тромбина (400 ед). В течение мин образовывался фибриновых гель.

Следовательно, основная функция фибриногена оставалась неизменной, а это говорит о том, что глубоких на- 30 рушений структурных единиц фибринового геля. †молек фибриногена не произошло.

Способ обеспечивает избирательную инактивацию плазминогена при нор- Зб мальной температуре без грубого изменения фибринового геля, т.е. без частичного обезвоживания и уплотнения. Зто позволяет достичь практически одинаковую плотность фибринового 40 геля на пластине с плазминогеном и на пластине с инактивированным плазминогеном. Зоны лизиса на облученной

Активатор Предлагаемый способ

Формула изобретения

Способ определения активаторов плазминогена, предусматривающий приготовление двух фибриновых пластин путем смешивания растворов, содержащих плазминоген человеческого фибриногена и тромбина, инактивацию плазминогена в одной из них, нанесение на пластины исследуемых растворов, инкубацию при оптимальной температу— ре реакции в течение 16-24 ч, измерение площади зон лизиса фибрина на обеих пластинах и вычисление активности по разности площадей зон лизи— са неинактивированной и инактивиро— ванной пластин, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения точности способа, инактивацию плазминогена осуществляют путем облучения ибриновой пластины ультрафиолетом .до энергетической экспозиции 1,42,6 Дж/см, причем расстояние между г пластиной и источником облучения устанавливают равным 35-45 см, |

Площадь зон лизиса (мм ) фибриновых пластин необлученной облученной

1472508

Таблица 3

Площадь зон лизиса (мм ) фибрин

Режимы облучения пластин (время, расстояние, экспозиция) облученной пластины необлученной пласактиваторная активтины ность

5 мин, расстояние 35 см, 0,7 Дж/см

10 мин, расстояние 35 см, 1,4 Дж/см

20 мин, расстояние 40 см, 2,1 Дж/см30 мин, расстояние 45 см, 2,6 Дж/см

115- 8 297

0 412

412 -20

412+ 20

412

412+20

412

412+20

Составитель Е.Воробьева

Техред Л.Сердюкова Корректор Б.Романенко

Редактор И.Сегляник

Заказ 1674/28 Тираж 501 Бодписно е

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101