Штамм вируса гепатита а для накопления биомассы, используемой для приготовления профилактических и диагностических препаратов

Штамм вируса гепатита а для накопления биомассы, используемой для приготовления профилактических и диагностических препаратов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к вирусологии, а именно к диагностике и вакцинопрофилактике гепатита А (ВГА). Цель изобретения - получение первого отечественного штамма ВГА, способного к размножению в перевиваемой культуре клеток с накоплением вирусной массы в количествах, достаточных для разработки профилактических и диагностических препаратов. Штамм ВГА Л-2424 депонирован в коллекции ГИСК под N177 и характеризуется свойствами, присущими ВГА. Штамм адаптирован к перевиваемой культуре клеток почек зеленой мартышки 4647, причем уровень продукции достаточен для разработки инактивированной вакцины против ГА и пригоден для специфической диагностики ВГА. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

Ai аа аи (594C 12 N7 00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ fHHT СССР

К ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4294237/28-13 (22) 05.08.87 (46) 23.04.89. Бюл. У 15 (71) Институт полиомиелита и вирус ных энцефалитов AMH СССР (72) Ю.I0. Кусов, Л.И. Панина, М.А. Донец, В.В..Вайткене и М.С.Балаян (53) 576.858(088.8) (54) ШТАММ ВИРУСА ГЕПАТИТА А ДЛЯ НАКОПЛЕНИЯ БИОМАССЫ, ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ДЛЯ

ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ И ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ (57) Изобретение относится к вирусологии, а именно к диагностике и вакИзобретение относится к вирусологии и предназначено для диагностики и вакцинопрофилактики вирусных инфекций, а именно инфекции вируса гепатита А (ВГА) °

Цель изобретения - получение штамма ВГА, способного,к размножению в перевиваемой культуре клеток с накоплением вирусной массы в количествах, достаточных для разработки профилактических и диагностических препаратов.

Штамм ВГА Л-2424 выделен- из со-. бранных за шесть дней до желтухи фекалий больного гепатитом.

Штамм ВГАЛ-2424 депонирован под

У 177 в коллекции Государственного института стандартизации и контроля цинопрофилактике гепатита А (ВГА).

Цель изобретения - получение первого отечественного штамма ВГА, способного к размножению в перевиваемой культуре клеток с накоплением вирусной массы в количествах, достаточных для разработки профилактических и диагностических препаратов. Штамм ВГА

Л-2424 депонирован в коллекции ГИСК под Р 177 и характеризуется свойствами, присущими ВГА. Штамм адаптирован к перевиваемой культуре клеток почек зеленой мартышки 4647, причем уровень продукции достаточен для разработки инактивированной вакцины против ГА и пригоден для специфической диагнос- с

<0 тики ВГА. 1 табл. медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича. .. Штамм ВГА31-2424 характеризуется следующими свойствами.

Частицы ВГА по данным электронной микроскопии имеют,D=27 нм. Основная масса частиц имеет плавучую э плотность 1,34 г/см в градиенте хлористого цезия и коэффициент седиментации 155-160 S „„ — в градиенте

1 нейтральной сахарозы.

По данным иммуноферментного анализа (ИФА) титр антигенной активности составляет 1: 16-1:32. По данным нммуноэлектронной микроскопии (ИЭМ) вирусные частицы взаимодействуют с предварительно аттестованной антиВГА сывороткой с образованием харак1474171 терного венчика из антител вокруг частиц. Следовательно и по известным морфологическим„ физико-химическим и антигенным свойствам штамм Л-2424 не отличается от естественно циркулирующего в природе ВГА. Содержащийся в 10%-ном фекальном экстракте вирус пассируют три раза н перевиваемой культуре клеток почек эмбриона 10 макаки резус (линия FRhK-4), а затем три раза — н перевинаемой культуре клеток почек зеленой мартышки

4647.

Штамм ВГА Л-2424 представляет собой взвесь заряженных вирусом клеток почек зеленой мартьппки 4647, собранных после заражения на 21 сут инкубации при 37 С. Титр инфекционной активности составляет т, 10 ТкИД „/мл, а титр антигенной активности ранен i:16-1."32. Морфологические (форма и размер частиц икосаэдр 27 нм), физико-химические (плавучая плотность 1,34 г/cM и коэф9 фициент седиментации 155-160 S щ) и серологические свойства (способность взаимодействовать с анти-ВГА антителами) штамма Л-2424 соответствуют характеристикам циркулирующих в природе штаммон ВГА. Полученный

Зр штамм Л-2424 8!А при размножении н культурах клеток FrhK-4 и 4647 является продуцентом вирусного антигена для специфической диагностики гепатита А. При размножении н разрешенной 35 для накционного производства культуре клеток 4647 штамм ВГА Л-2424 используют для накопления вирусной мас сы при производстве инактиниронанной вакцины против гепатита А.

Пример 1, Штамм ВГА Л-2424— продуцент вирусного антигена для специфической диагностики гепатита А.

Собранные за шесть дней до желтухи фекалии больной с клинически выраженным диагнозом гепатита А гомогенизирумт н 0,1 М фосфатно-соленом буфере рН 7,4 в гомогенизаторе в виде 10%-ной суспензии, добавляют

Ол равный объем охлажденного (О С) фреона-113, экстрагируют н течение 10 мин и центрифугируют для расслоения фаз при 1500 об/мин в течение 10 мин.

Полученный фекальный экстракт со55 держит вирусные частицы размером

27-30 нм, которые взаимодействуют с предварительно аттестованной сыноротве кой с образованием характерного венчика из антител (данные ИЗМ) . По данным изоциклического центрифугирования в хлористом цезии основная популяция части имеет плавучую плотность 1,34 г/см . Коэффициент седиз ментации этих частиц равен 155160 S ® как следует из данных центрифугиронания (35000 об/мин, 2 ч, о

5 С) в градиенте плотности сахарозы (10-35%). Вирусные частицы способны взаимодействовать с анти-ВГА антителами, как следует из данных ИФА и ИЭМ.

В 10%-ный фекальный экстракт добавляют по 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина, а также канамицин до конечной концентрации 100 мкг/мл и выдерживают при 37" С н течение 4 ч, полученную смесь инокулируют в течео ние 2 ч при 37 С на предварительно хорошо сформированный монослой перевиваемых клеток почек эмбриона макаки резус (линия FRhK-4). В качестве среды роста применяют среду ИглаМЕМ с удвоенным содержанием аминокислот и витаминов (Игла-2MEM), содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки, а в качестве среды попдержания - среду Игла-2МЕМ с 1% эмбриональной телячьей сыворотки. Среду поддержания меняют один раз в неделю. о

Через 42 дня инкубации при 37 С сливают с монослоя клеток культуральную жидкость, монослой промывают раство-! ром Хенкса и снимают клетки в среде

Игла-2МЕМ без сыворотки после пред варительной кратковременной обработки монослоя клеток 0,02%-ным раство ром ЭДТА. Содержащийся в культуральной жидкости вирус концентрируют путем осаждения 10%-ным полиэтиленгликолем (ПЭГ-6000) в течение 16 ч о при 4 С, собранный при центрифугировании осадок (1000 об/мин, 30 мин) восстанавливают в 1/30 объема исходной культуральной жидкости, и полученный концентрат обдъединяют с лизатом заряженных клеток. Клетки разрушают путем пятикратного замораживания (-70.С) и оттаивания (+in С).

Объединенную таким образом смесь используют в качестве инокулята для следующего пассажа вируса. На уровне 4 пассажа срок рамножения (21 сут) и продукция вируса как по антигенной (титр 1:64), так и по .инфекционной (10 ТкИДхо/мл

Формула изобретения

20 Номер пассаАнтигенная акСрок инкубации, сут

Температура инкубации, С тивность (метод

ИФА)

-1082

О

2

4

1

4

2

4-5

32

32

32

32

32

32

37

37

37

37.

37

7

33

12

22

27

12

22

27

7 . 15

ЗО 2

Составитель. А.Ианыкин

Техред А.Кравчук,. Корректор С.йекмар

Редактор Н.Гунько

Заказ 1840/23 Тираж 501 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35 ° Раушская наб., д. 4/5 г производственно-,издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина,301

5 14 тивности близки аналогичным парамет-, рам для системы HAS-15/FRhK-4. Уро1 вень продукции вирусного антигена достаточен для изготовления диагностических препаратов к гепатиту А.

Пример 2. Штамм ВГА Л-2424— продуцент вирусной массы для изготовления инактивированной вакцины для специфической профилактики гепатита А.

Выделение вируса из фекалий и адаптацию штамма Л-2424 к размножению в культуре клеток FRhK-4 проводят как описано в примере 1, но штамм ВГА Л-2424 адаптируют к перевиваемой культуре клеток почек зеленой мартьппки 4647.

Адаптацию штамма Л-2424 в культуре клеток 4647 проводят следующим образом.

Хорошо сформированный монослой клеток 4647 инокулируют в течение

2 ч при 37 С вирусосодержащим материалом, полученным путем разрушения

5-кратным замораживанием (оттаиваниI ем зараженных клеток, собранных на

44 сут третьего пассажа штамма

ВГА Л-2424 в культуре клеток FRhK-4).

Для последующего пассирования вируса используют лизат зараженных штаммом ВГА Л-2424 клеток, собранных на максимальный срок размножения предыдущего пассажа. В качестве среды роста и среды поддержания используют среду Игла-2МЕМ 10Х и эмбриональной телячьей сыворотки 1Х. Условия культивирования те же, что и в примере 1, за исключением температуры инкубации. Как видно из,описанных данных, по мере пассирования происходит адаптация штамма ВГА Л-2424 к культуре 4647. Достигнутый на уровне

74171 6 третьего пассажа штамма ВГА Л-2424 уровень продукции вируса сопоставим с ранее описанным для систем

HAS-t5/4647, что позволяет создавать препараты инактивированной вакцины против гепатита А.

Данные адаптации штамма вируса гепатита А Л-2424 к перевиваемой

10 культуре клеток почек зеленой мартьппки 4647 приведены в таблице.

15 Штамм вируса гепатита А ГИСК У177 для.накопления биомассы, используемой для приготовления профилактических и диагностических препаратов.

40 В качестве инокулума используют вирус„ полученный на 44 сут в резуль тате третьего пассажа в культуре клеток FRhK-4 (пример 1).