Способ определения активности фосфолипазы а.

Способ определения активности фосфолипазы а.

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к медицине и предназначено для определения активности фосфолипазы А. Цель - повышение чувствительности и ускорение способа. Измеряют скорость изменения поверхностного потенциала на бислойной мембране при ферментативном гидролизе методом автоматической компенсации внутримембранного электрического поля, которую регистрируюут по отсутствию второй гармоники емкостного тока. 3 ил.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (51)4 G 01 N 33/68

ОПИСАНИЕ ЗОБРЕТЕНИЯ„

Н A ВТОРСЙОМ,К СВИДЕТЕЛЬСТВУ

W АЧ С

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И OTHPbITHRM

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4259638/28-14 (22) 12.05.87 (46) 23.04.89. Бюл. Р 15 (71) Институт электрохимии им. А.Н.Фрумкина (72) В.M.Мирский, В.В.Черный, В.С.Соколов, M.В.Симонова и В.С.Маркин (53) 61 2. 015 (088. 8) (56) Авторское свидетельство СССР

У 1416918, кл. С 01 N 33/48, 30.07.87.

Изобретение относится к способам определения активности фосфолипазы А и может быть использовано в медицине и биологии, например, для определения активности панкреатической. фосфолипазы при диагностике заболеваний поджелудочной железы.

Цель изобретения — повышение чувствительности, ускорение способа и возможность измерений активности в присутствии примесей в исследуемом образце путем измерения разности поверхностных потенциалов бислойной липидной мембраны для определения скорости ферментативного гидролиза.

На фиг. 1 — 3 приведены графические зависимости.

Пример 1. Построение калибровочной кривой для коммерческого препарата фосфолипазы А фирмы "Калбиохем" (ФРГ).

Ячейку заполняют раствором

100 мМ КС1, 20 мМ имидазола, рН 8,9.

Бислойные липидные мембраны формиÄÄSUÄÄ 1474550 А1 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

ФОСФОЛИПАЗИ А (57) Изобретение относится к медицине и предназначено для определения активности фосфолипазы А. Цель — повышение чувствительности и ускорение способа. Измеряют скорость изменения поверхностного потенциала на бислойной мембране при ферментативном гидролизе методом автоматической компенсации внутримембранного электрического поля, которую регистрируют по отсутствию второй гармоники емкостного тока. 3 ил.

Рант на оаотаора яняного фоофатнтнт- Я холина в декане. В ячейку добавляют

ЭДТА (до концентрации 0,2 мМ, в оба отсека ячейки), через 2 мин — раствор фосфолипазы, через 2 мин — хлористый кальций (до концентрации 5 мМ, в оба отсека ячейки).

Результаты показаны на фиг. 1-3.

За единицу активности фермента принимают такую активность, при которой за 1 ьын образуется 1 нМ жирных @ кислот. По калибровочным кривым,,Ю построенным для препарата известной активности, можно определять активность неизвестного препарата.

Величина фосфолипаэной активности может быть определена по формуле, основанной на электрохимической модели, Ъ где V — скорость изменения поверхностного потенциала (В/с) на начальном участке (фиг. 1); А=2,4 .10 ;

С вЂ” концентрация фоновсго э.-гектроли1474550 та ; Ы вЂ” активность фосфолипазы (количество моль жирных кислот, образующихся за 1 с на 1 м мембраны).

Пример 2. Определение фос5 фолипазной активности панкреатического сока.

Измерения проводят так же, как и при построении калибровочной кривой (пример 1), но мембрану формируют из азолектина, а вместо фосфолипазы добавляют 10 мкл панкреатического сока человека, полученного при зондировании протока поджелодучной железы. Кинетика изменения поверхностного потенциала показана на фиг. 1. Величина активности, рассчитана по наклону начального участка кривой, АмВ/мин (для данных условий)

W = 3.6 10 мс: м

Такое же значение получается при проведении анализа в присутствии жедчи (на 10 мкл панкреатнческого сока добавляют 10 мкл желчи).

Использование бислайной липидной мембраны в качестве субстрата и применение метода автоматической компенсации внутримембранного поля для измерения поверхностного потенциала этой мембраны позволяет создать метод определения активности фосфолипазы А в растворе. Предлагаемый способ имеет более высокую точность и чувствительность, чем известный не требует тщательной очистки препарата и реагентов, может быть использован для измерений в присутствии примесей, позволяет проводить анализ быстро и с малым количеством образца, Формула и з обретения

Способ определения активности фосфолипазы А в растворе путем измерения скорости изменения поверхностного потенциала на бислойной липидной мембране при ферментативном гидролизе отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности, ускорения способа и возможности измерения активности в присутствии приме- сей, измерение поверхностного потенциала осуществляют методом автоматической компенсации внутримембранного электрического поля, регистрируемой по отсутствию 2-й гармоники емкостного тока.

1474550

0.5 аз 0.6

0онцентрация, иг/мл

0.6

Корректор С.Черни

Редактор Н.Тупица

Заказ 1887/42 Тираж 788 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101 и3 иин

1 2 Ю

A 0A g mpcrcoA роеролилазы, усл. ед

Фиг. 8

02 ОФ

Актиднаслзь, еФ/ил

Фиг. 3

Составитель Л.Сабурова

Техред Л.Сердюкова