Способ получения гидрогеназы

Способ получения гидрогеназы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к области промышленной микробиологии и может быть использовано в инженерной энзимиологии, биокатализе, медицине и в научных исследованиях при изучении биохимии процессов дыхания и фотосинтеза. Целью изобретения является повышение выхода и увеличение удельной активности гидрогеназы и удешевление процесса. При выделении гидрогеназы предлагается использовать предварительную обработку биомассы клеток бактерий охлажденным ацетатом, что позволяет значительно повысить выход гидрогеназы и одновременно получить биологически активные соединения: убихинон Q<SB POS="POST">8</SB> и менахинон MQ<SB POS="POST">8</SB>. Окончательную очистку гидрогеназы проводят методом повторной хроматографии на фенилсефарозе CL- 4B, в результате чего резко возрастает степень очистки и удельная активность гидрогеназы. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Б

Г.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4323905/31- 13 (22) 02.11.87 (46) 07.05.89. Бюл. Ф 17 (71) Институт почвоведения и фотосинтеза АН СССР (72) Н.А.Зорин, О.Ф.Корсунский и И.Н.Гоготов (53) 577 ° 15(088.8) (56) Газарян А.А. и др. Очистка гидрогеназы водородоокисляющих бактерий

Alcaligenes Futrophus Z1 гидрофобной хроматографией. — Прикладная биохимия и микробиология, 1983, XIX Р 6, с. 751-757 °

Гоготов И.Н., Зорин Н.А., Кондратьева Е.И. Очистка и свойства гидрогеназы из фототрофной бактерии

Thiocapsa roscopercisina. — Биохимия, 1976, т. 41, Р 5, с. 836-842. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИЛРОГЕНАЗЫ (57) Изобретение относится к области

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к микробиологическому синтезу биологически активных веществ, и может быть использовано в инженерной энзимологии для синтеза соединений, меченых изотопами водорода, в научных исследованиях для изучения процессов биокатализа и преобразования световой энергии в молекулярный водород.

Целью изобретения является поныв шение выхода, увеличение удельной активности гидрогеназы, расширение

ÄÄSUÄÄ 1477741 А1 (51) 4 С 12 М 9/02//C 12 Р 7/66 промышленной микробиологии и может быть использовано в инженерной энзимиологии, био..=:т-.ëèsс, медицине и в научных исследова;н .»х при изучении биохимии процессог. дыхания и фотосинтеза. Целью изобретения является повышение выхода и увеличение удель" ной активности гидрогеназы и удешев" ление процесса. При выделении гидрогеназы предлагается использовать предварительную обработку биомассы клеток бактерий охлажденным ацетатом, что позволяет значительно повысить выход гидрогеназы и одновременно получить биологически активные соединения: убихинон Ц; и менахинон

МО . Окончательную очистку гидрогеназы проводят методом повторной хроматографии на фенилсефарозе С1.-4B, в результате чего резко возрастает степень очистки и удельная активность гидрогеназы. 1 табл.

2 технологических возможностей и удешевление процесса.

Изобретение rозволяет одновременно с гидрогеназой получить биологически активные вещества: убихинон Qs u менахинон М(1;.

Сущность изобретения заключается в том, что перед разрушением ультразвуком клетки бактерий обрабатывают охлажденным ацетоном, а после отде— ления ацетона и нерастворимого остатка клеток из растворимой фракции гидрогеназу выделяют фракционированием

1477741 сульфатом аммония без предварительной термообработки, очистку гидрогеназы проводят хроматографией на фенилсефарозе СЕ-4В, повторяя эту операцию дважды. Отделенный ацетононый экстракт упаривяют и после омыления липидной фракции из него выделяют убихинон 0 и меняхинон МО .

Предварительная обработка клеток бактерий охлажденным ацетоном позволяет извлечь каротиноиды, хлорофиллы, липиды, хиноны и другие липофильные соединения, частично разрушить структуру мембран, повьппает солюбилизяцию белков, способствуя, тем самым, повышению выхода фермента.

При предварительной термообряботке бесклеточного экстракта происходит денатурация термолабильных белков, которые, выпадая в осадок, соосаждают частично гидрогенязу, что уменьшает выход фермента. Если термообработку проводить после фракционирования сульфатом аммония, то устраняются сорбционные потери гидрогеназы и при предварительном фракционировании (NHg)g SOy устраняется часть белка, не обладающая ферментятинной активностью, что способствует более полному выделению гидрогенязы.

Пример 1. Клетки Thiocapsa

roseopercisina штамм BBS выращивают по известной методике н янаэробных условиях.

150 г сырых клеток суспендируют в 150 мл 0,02 И кяльцийфосфатном буфере (рН 7,0) с помощью магнитной мешалки в течение 1 ч. К полученной суспензии добавляют 1,5 л охлажденного ацетона, перемешивают. Клетки отфильтровывают в воронке Бухнеря под вакуумом и промывают 1 л охляжденног0 ацетона, Экстракты объединяют для получения убихинона Яя и менахиноня

МЧ8 °

Клетки после обработки ацетоном высушивают под вакуумом и суспендируют в дистиллированной воде в соотношении 1:20, суспензию обрабатывают ультразвуком ня дезинтеграторе в течение 30 мин при 22 кГц. Растворимую фракцию, содержащую гидрогеназу, отделяют центрифугированием в течение 30 мин при 5000 g.

К супернатанту добавляют до 30% нясьпцения сульфат аммония и выпавшие в осадок примесные белки и мембранные фракции клеток отделяют

40 при 40-45 С. К сухому остатку прйливают смесь, состоящую из 200 мл

96%-ного этанола, 130 мл дистиллированной воды, 12,6 г КОН и 6 r пирогаллоля, нагревают до кипения и проводят омыление в течение 25 мин в токе аргона, Смесь охлаждают на бане со льдом и проводят экстракцию хинонов из неомыленной фракции гексаном (Зх100 мл). Гексан упаривают на роторном испарителе. Сухой краснокоричневый осадок растворяют в 3 мл смеси для элюции и хроматографируют на колонке с окисью алюминия. Элюцию проводят смег.ью петролейный эфир (т.кип.40-70 С) — хлороформ—

55 диэтиловый эфир в отношении 85: 10: Ь.

Фракцию н ниде ярко-желтой полосы с 1 = П,7, содержащую менахинон, и фракцию н виде ярка-оранжевой по5

2G

25 центрифугировянием в течение 60 мин при 5000 д. Для осаждения гидрогенязы концентрациюсульфятя аммония увеличиняют до 70% и суспензию центрифугируют в течение 15 мин при 5000 g.

Осадок, содержащий гидрогеназу, растворяют в 150 мл 0,02 М калийфосфатного буфера, рН 7,0 и полученный раствор прогренают н течение

10 мин при 70 С для удаления термолибильных белков. Денатурированные белки осаждают центрифугировянием в течение 30 мин при 5000 g и для дальнейшей очистки гидрогеназы су-, пернатант наносят на колонку (1,5х

xf5 см) с фенилсефарозой CL-4В, уравновешенную 0,8 М раствором сульфата аммония в 0,02 М калийфосфятном буфере, рН 7,0. Колонку с адсорбированной на ней гидрогеназой промывают вначале 100 мл 0,8 If, а затем тем же объемом 0,2 М раствором сульфата аммония. Гидрогеназу элюируют дистиллированной водой до полной элюции и подвергают повторной хроматографии на колонке с фенилсефарозой

С1-4В. Для более тонкой очистки фермент элюируют из колонки понижающимся градиентом концентрации раствора сульфата аммония объемом 100 мл в диапазоне 0,2-0,004М. Полученные по данной методике препараты гидрогеназы обладают высокой удельной активностью.

Характеристики гидрогенязы приведены в таблице.

Ацетоновый экстракт упаривают на роторном испарителе под вакуумом упаривают и определяют количество полученных препаратов спектрофотометрически в абсолютном этаноле, используя соответствующие коэффициенты экстринкции.

Выход составляет, мг/г сухих клеток:

Гидрогеназа

Убихинон (1

Менахинон МО

Формула изобретения

Преимущества пр едла гаемог о спос оба по сравнению с известным заключаются в увеличении в три раза выхода фермента, значительном увеличении удельной активности и степени очистки гидрогеназы, в возможности получения из одной порции биомассы дополнительного ряда биологически ак— тивных соединений, т.е. при получении определенного количества гидрогеназы, убихинона и менахинона происходит экономия сырья реактивов, энергии, рабочего времени. Кроме

Характеристика известному предлагаемому

Удельная активность, мкмоль

-1

Н мин ° мг белка

Степень очистки

Выход фермента, 7.

28,0

350,0

20,0

3,45

51,6

6,6

Составитель А. Спундэ

Техред А.Кравчук Корректор М.Максимишинец

Редактор Н ° Гунько

Заказ 2316/25 Тираж 501 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. жгород, ул. Гагарина,101

5 14 лосы с R = 0,5, содержащую убихинон, собирают отдельно, упаривают и рехроматографируют на колонке с окисью алюминия в системе петролейный эфирпиэтиленовый эфир — ледяная уксусная кислота в отношении 90:30:1, Элюат

77741 6 того, отсутствие длительных стадий при очистке гидрогеназы, таких как гель-фильтрация и препаративных5 электрофорез в полиакриламидном геле позволяют значительно сократить время получения гидрогеназы.

Способ получения гидрогеназы с проведением воздействия на клетки

Thiocapsa roseopercisina штамм HBS ультразвука, термообработки, ступенчатого фракционирования сульфатом аммония и очистки фермента, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения выхода и удельной активности гидрогеназы, расширения

2р техпологических возможностей и удешевления процесса, перед воздействием ультразвуком проводят обработку клеток охлажденным ацетоном, ступенчатое фракционирование проводят перед

25 термообработкой, а очистку осуществляют двукратной гидрофобной хроматографией на поперечно-сшитом поли. мере агарозы с ковалентно присоединенными фенильными группами, способном

30 фракционировать белки с мол.массой

6 ° 10" — 2 10 дальтон.