Способ выделения эндонуклеазы из культуральной жидкости sеrrатiа маrсеsсеns

Способ выделения эндонуклеазы из культуральной жидкости sеrrатiа маrсеsсеns

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Эндонуклеаза, выделяемая из культуральной жидкости SERRATIA MARCESCENS, гидролизующая нуклеиновые кислоты до ди-, три-, тетра-, и олигонуклеотидов, применяется для лечения и профилактики вирусного паралича пчел, для изучения структуры хроматина, может служить моделью для исследования влияния одновременного наличия сульфгидрильных и дисульфидных групп на конформационные переходы молекул. Цель изобретения - упрощение и ускорение процесса. Способ выделения эндонуклеазы из культуральной жидкости S.MARCESCENS включает катионообменную хроматографию на бикарбе с сорбцией фермента при рН 5,0-5,5 и десорбцией при рН 8,0-8,5 в присутствии 0,35-0,40 М хлористого натрия. Способ позволяет за 40-45 ч из 100 л культуральной жидкости выделить 70-110 г препарата, содержащего 7-14 г белка без уменьшения степени чистоты препарата с сокращением времени выделения фермента в 8-10 раз и упрощением процесса по сравнению с известным. 1 з.п. ф-лы.

ф

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (51) 4 С 12 N 9/14

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ WHT СССР (21) 4306951/31 — 13 (22) 26.06.87 (46) 07.05.89. Бюл ¹ 17 (71) Казанский государственный университет им.В.И.Ульянова-Ленина, Вышневолоцкий завод ферментных препаратов и Институт высокомолекулярных соединений АН СССР (72) М.Н.Филимонова, И.Б.Лещинская, P Б.Пономарева, В.И.Гребеньков, В.Н.Жбанова, Т .Д .Муравьева и К.П.Папукова (53) 577.15(088.8) (56) Yonemura К., Matsumoto К., Maeda Н. Isolation and Characterization of Nuclease from Clinical

Isolate of Serratia marcescens.

J. Biochem., 1983, . 93, ¹ 5, р. 1287.

Авторское свидетельство СССР

¹ 537512, кл. С 12 N 9/10, 1972.

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения фермен— тов, в частности внеклеточной бактериальной эндонуклеазы.

Целью изобретения является упрощение и ускорение процесса.

Способ выделения эндонуклеазы из культуральной жидкости S.marcescens основан на том, что катионообменную хроматографию проводят на катионообменнике. Биокарб Д-24 с сорбцией

ÄÄSUÄÄ 1477742 Д1 (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ

ИЗ КУЛЬТУРАЛЪНОЙ ЖИДКОСТИ SERRATIA

MARCESCENS (57) Изобретение предназначено для лечения и профилактики вирусного .паралича пчел, для изучения структуры хроматина, может служить моделью для исследования влияния одновременного наличия сульфгидрильных и дисульфидных групп на конформационные переходы молекул. Цель изобретения — упрощение и ускорение процесса. Способ выделения эндонуклеазы из культуральной жидкости S.marcescens включает катионообменную хроматографию на биокарбе г с сороцией фермента при рН 5,0-5,5 Я и десорбцией при рН 8,0-8,5 в присутствии 0,35-0,40 М хлористого натрия. Способ. позволяет за 40-45 ч из 100 л культуральной жидкости выделить 70 †1 г препарата, содержащего 7-14 г белка, без уменьшения степени чистоты препарата с сокращением времени выделения фермента в

4:ь

8-10 раз и упрощением процесса по сравнению с известным. 1 з.п. ф-лы.

2 И) целевого продукта при рН 5055 и цесорбцией при рН 8,0-8,5 в присутствии 0,35-0,40 М хлористого натрия.

Пример 1. Г>иокарб Д-24 800 г (по сухому весу) уравновешивают

О, 10 М натрий-ацетатным буфером рН 5,2, перемещают в колонку диаметром 2530 см. 100 л культуральной жидкости подкисляют концентрированной уксусной кислотой до рН 5,2 и наносят на сорбент со скоростью 60 мл/см" ч (около

1477742

Формула и з о б р е т е н и я

1,: Способ выделения эндонуклеазы из культуральной жидкости >erratia

marcescens включающий очистку методом ионообменной хроматографии, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью упрощения и сокращения длительности процесса, ионообменнрй хроматографии подвергают непосредственно культуральную жидкость, а ионообменную хроматографию проводят на катионообменнике Биокарб Д-24 с сорбцией целевого продукта при рН

5,0-5,5 и десорбцией в буфере при рН 8,0-8,5 в присутствии 0,350,40 М хлористого натрия.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что для десорбции в качестве буфера используют 0 1 М трис-HCl.

Составитель А. Семенов

Редактор А. Гунько Техред A.Êðàí÷óê Корректор 3.Лончакова

Заказ 2316/25 Тираж 501 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Па-.ент", r.Óæãoðoä, ул. Гагарина, 101

30 л/ч) при соотношении белок:сорбент не более 700 ед. А !! . 1 см бискарба. По завершении сорбции колонку промывают 25,5 л (15-кратный объем)

0,05 М трис-НС1 буфера, рН 8,5. 3a- .

5 тем элюируют фермент 8,5 л (5-кратный объем) 0,10 М трис — НС1 буфера рН 8,5, содержащего 0,40 М хлористого натрия.

Полученный элюат высушивают при дроб- 1О ном режиме. При этом выход фермента составляет 65-703, активность не менее 30000 ед,акт./мг белка. Из

100 л культуральной жидкости удается выделить более 100 r препарата, содержащего более 10% белка.

Пример 2. Биокарб Д-24: уравновешивают 0,10 М натрий-ацетат- ным буфером, рН 5,0 и помещают в колонку как в примере 1. Культураль- 20 ную жидкость подкисляют концентрированной уксусной кислотой до рН 5,0 и помещают на колонку как в примере 1. Сорбция эндонуклеазы составляет

90-95Х, Промывку колонки и элюцию фермента проводят как в примере 1.

При этом выход фермента составляет

60-65Х, активность около 25000 ед.акт./

/мг белка.

Пример 3. Биокарб Д-24 уравновешивают О, 10 М натрий-ацетатным буфером, рН 5,5 и помещают в колонку как в примере 1. Культуральную жидкость подкисляют концентрированной уксусной кислотой до рН 5,5 и помещают на колонку как в примере 1. Сорбция эндонуклеазы составляет 40-87 ",.

Промывку колонки и элюцию фермента проводят как в примере 1. При этом выход фермента составляет 35-652, ак4О тивность около 30000 ед.акт./мг

I белка.

Пример 4. Биокарб Д-24 уранновешивают и помещают в колонку как в примере 1. Культуральную жидкость наносят на колонку как в примере 1.

Промывку колонки про :,одят как в примере 1. Фермент элюируют 0,1 М трис-НС1 буфером, рН 8,0, содержащим.

0,35 М хлористого натрия. При этом выход фермента составляет 60-657., активность, более 30000 ед,акт,/мг белка.

Пример 5. Биокарб Д-24 уравновешивают и помещают а колонку как в примере 1. Культуральную жидкость наносят на колонку как в примере 1.,Промывку колонки проводят как в примере 1. Фермент элюируют 0,1 М трис-HCl буфером рН 8, 5, содержащим

0,35 М хлористого натрия. При этом выход фермента составляет 65-707.. активность более 30000 ед.акт./мг белка, При осуществлении способа в усло. виях, отличающихся от описанных, выход целевого продукта снижается.

Реализация способа обеспечивает упрощение и ускорение процесса.