Способ определения антигенов или антител

Способ определения антигенов или антител

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к области медицины и сельского хозяйства, а именно к иммунологии, и может быть использовано при анализе иммунных препаратов на твердой поверхности. Целью изобретения является повышение точности способа. Поставленная цель достигается тем, что на поверхности датчика, имеющего опорную и измерительную линии задержки на поверхностных акустических волнах, формируют монослой специфических антигенов или антител, на поверхность измерительной линии наносят известное количество анализируемого раствора, инкубируют во влажной камере, промывают, высушивают, и измеряют разность времен прохождения акустической волны в опорной и измерительной линиях задержки и по калибровочной кривой находят количество специфических антител или антигенов. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

ÄÄSUÄÄ 1478122 (59 4 G 01 N 33/53 // G 01 N 33/483

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ измерить.

Зависимость скорости распространения волны от толщины слоя имеет вид

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

IlO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4206843/28-14 (22) 21.01.87 (46) 07.05.89. Бюл. № 17 (71) Научно-производственное объединение "Агроприбор" и Институт биохимии им А.H. Баха . (72) П.П. Дебелый, Л.А. Дьяченко, Б.Б. Дзантиев и И.Т. Геллер (53) 615.373 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР № 1410665, кл. G 01 N 33/53, 1987. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ

ИЛИ АНТИТЕЛ (57) Изобретение относится к области медицины и сельского хозяйства, а именно к иммунологии, и может быть использовано при анализе иммунных

Изобретение относится к медицине и сельскому хозяйству, а именно к иммунологии, и может быть использовано при анализе иммунных препаратов на твердой поверхности.

Целью изобретения является повышени е точности способа .

Способ осуществляют следующим образом. .На поверхности ПАВ-датчика, имеющего опорную и измерительную линии задержки, размещенные на одной под,ложке, путем адсорбции из раствора формируют мономолекулярный слой специфических антигенов или антител, затем на поверхность измерительной линии задержки наносят известное количество анализируемого раствора,ин.кубируют датчик во влажной камере, препаратов на твердой поверхности.

Целью изобретения является повышение точности способа. Поставленная цель достигается тем, что на поверхности датчика, имеющего опорную и измерительную линии задержки на поверхностных акустических волнах,формируют монослой специфических антигенов или антител, на поверхность измерительной линии наносят известное количество анализируемого раствора, инкубируют во влажной камере, промывают, высушивают, измеряют разность времен прохождения акустическсй волны в опорной и измерительной линиях задержки и по калибровочной кривой находят количество специфических антител или антйгенов.1 табл. промывают, высушивают, после чего измеряют разность времен прохождения акустической волны в опорной и измерительной линиях задержки и по измеренной величине наносят количество исследуемого антитела или антигена по ранее построенной калибровочной кривой.

Для доказательства применимости предлагаемого способа необходимо показать, что приращения толщины молекулярных слоев за счет образования иммунных комплексов достаточно для изменения скорости поверхностной акустической волны, причем настолько, чтобы была возможность это изменение

14 781 22

1Ч вЂ” V(h) 7/Ч = g 2i>Fh/Ч где V V(h) — скорости поверхностной в ол ны на с в об од н ой и покрытой слоем поверхнос ти; коэффициент, хара кт еризующий цисперсионные свойства слоистой системы;

F — рабочая частота ПАВдатчика.

Если использовать ПАВ-датчик в качестве частотозадающего элемента автогенератора, то при изменении ско— рости V относительное изменение частоты генератора Г будет составлять

Р - F(h) V V(h) F V

Следовательно, относительное изменение скорости может регистрироваться с т ем же ра зр еще ни ем, с каким регистрируется относительное изменение чж тоты, т. е. на уровне

10 — 10

Чувствительность к толщине, рас— считанная по формулам, для слоев с т ".-10 и пьезокварцевых датчиков

У,Х-среза (Ч = 3159 м/с) с частотами

10 и 100 МГц равна 20 и 2000 Гц/нм соответственно. Отсюда следует, что ,минимально регистрируемые приращения толщины л h „„,„составят 10 35

I0 м, что находится на уровне элип,- ометрич еского метода, предложенного в прототипе.

11овыспть чувствительность можно путем увеличения частоты ПА — датчи- 40 ка. Современная технология обеспечивает возможность создания ПАВ-датчиков, частоты которых могут лежать в диапазоне до 1 ГГц.

Пример 1. Определение коли- 45 ч ества и нсули на в раствор е.

Использовались ПАВ- датчики с дву— мя линиями задержки на пьезокварцевом кристалле Y,Х-среза, основ— ная чистота 10 11Гц.

Разведение всех компонентов реакции проводят на 0,01 M фосфатном буфере (ФБ) с pl- 7 4.

Этап A. ПАВ-датчик вносят в раствор иммуноглобулинов с концентрацией

10 мкг/мл, выделенных из антиинсулиновой сыворотки морской свинки, инкуо бируют в течение ночи при 4 С,промывают датчик, не вынимая из раствора

Раствор

Расч етная Измеря емая концентрация, раз иост ь мкг/мл частот, Гц

268

210, 166

128

83

1

3

5

8

210,0

i 80, 5

149,0

105,0

78,0

57,6

26,3

6,6

Пример 2. Определение копич ест ва а нтит ел в сывор отк е.

100 мл ФБ„содержащего 0,05Х твина-20 (ТФБ), вынимают из раствора и обдувают его рабочую поверхность струей инертного, газа для удаления капель ТФБ.

Этап Б. На поверхность одной из линий задержки наносят 100 мкл анализируемого раствора, разведенного в ТФБ, Инкубируют во влажной камере при

37 С 2 ч. Затем поверхность датчика отмывают от несвязавшихся молекул инсулина 100 мп ФБ и 100 мл дистиллированной воды. Сушку датчика производят в среде, осушенной селикагелем до тех пор, пока измеряемая частота разностного сигнала в опорной и измерительной линиях задержки повторится не менее 10 раз подряд. Измерение проводят путем включения датчика в цепь обратной связи усилителя,возбуждающегося на частоте, определяемой временем задержки ПАВ-датчика °

В таблице представлены результаты проведенного анализа (приведенные значения являются средними по результатам двух измерений).

Один датчик можно использовать для проведения двух анализов, не повторяя этап А, для чего аликвоту анализируемого раствора нанОсят на поверхность опорной линии задержки, а измерительную используют в качестве опорной. Затем необходимо поверхность датчика очистить от продуктов реакции. Очистку производят путем выдерживания датчика в 10Х-ном водном растворе тринатрийфосфата в течение 1 ч при комнатной температуре с последующим промыванием в дистиллированной воде.

14 78122

Составитель П. Бонарцев

Техред Л.Олийнык Корректор C. НеР ни

Редактор С. Пекарь

Заказ 2357/44 Тираж 790 Подписное

ВНИИПИ Государ :твениого комитета по изобретениям и открытиям при ГЕНТ СССР

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101

Использовались ПАВ-датчики У,Хсреза, с частотой 10 MI ö и классы

IgG, IgM, IgA, выпускаемые ИЭМ им. П.Ф. Гамалея AMH СССР.

Этап А. Для адсорбции антигена на поверхность датчиков готовят раствор чистых IgG в ФБ с концентрацией

10 мкг/мл. ПАВ-датчики вносят в приготовленный раствор и инкубируют 10 в течение ночи при i 4 С. Промывают датчики, не вынимая из раствора, 100 мл ТФБ, затем вынимают датчики из раствора и обдувают рабочую поверхность очищенной струей инертного газа.

Этап Б. На поверхность измери— тельных линий задержки наносят по

100 мкл исследуемого раствора сыворотки различных разведений. Разведе- 20 ния сывороток готовят в ТФБ. Инкубируют сыворотки с адсорбированным иммуноглобулином 1 ч при 37 С. Для исключения влияния качества промывки на результат измерения.и контроля специфичности реакции на опорные линии задержки наносят по 100 мкл контрольного раствора сыворотки без анализируемых антител. После инкубации поверхность датчика отмывают от 30 несвязавшихся антител 100 мл ФБ и дистиллированной воды. Сушку и измерение проводят по примеру 1.

Уровень антител в исследуемых сыворотках оценивают по калибровочному графику зависимости частоты разност35 ного сигнала от разведения контроль— ных сывороток.

Таким образом, из приведенных примеров следует, что чувствительность предлагаемого способа при использовании ПАВ-датчиков с частотой 10 ИГц и точности регистрации частоты 1 Гц составила 0,5 мкг/мл, что не хуже, чем в прототипе. Однако, как следует из описания изобретения, повышение чувствительности не менее, чем на

2 порядка, представляет собой чисто техническую задачу, связанную с повышением рабочей частоты ПАВ-датчика до 1 ГГц.

Кроме того, предварительная подготовка датчиков по этапу А, например использование готовых иммунологич ес ких наборов, позволя ет з начительно сократить время анализа ° Если сравнить время этапа Б, затраченное на исследование восьми растворов в двух повторностях для прототипа и предлагаемого способа, то окажется, что для прототипа требуется на 5 ч больше. Поэтому технико-экономические преимущества изобретения по сравнению с прототипом являются очевидными.

Формула изобретения

Способ определения антигенов или антител путем иммобилизации на твердой поверхности датчика антител или антигенов с последующим нанесением исследуемого раствора, инкубацией, пр омывани ем, высуши вани ем, и змерением акустических характеристик и определением количества антигенов или антител по калибровочной кривой,о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения точности способа, исследуемый и контрольный растворы наносят соответственно на поверхность датчика в области измерительной и опорной линий задержки акустических волн, а измерение акустических характеристик осуществляют по разности времени прохождения акустической волны в опорной и измерительной линиях задержки .