Способ получения интерлейкина-2 человека

Способ получения интерлейкина-2 человека

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к области генетической инженерии и касается способа получения интерлейкина - 2 человека в клетках бактерий ESCHERICHIA COLI. Целью изобретения является повышение выхода интерлейкина - 2. Повышение выхода белка в клетках ESCHERICHIA COLI обеспечивается за счет того, что конструируют рекомбинантные плазмидные ДНК PTJΑ 2-22, PTU-JΑ 2-22, PGJΑ 2-22, PTJΑ 2-21а, PTJΑ 2-21в, кодирующие синтез интерлейкина -2, полученными плазмидами трасформируют бактериальные клетки E.COLI. 3 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ПАТЕНТ,Ф

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 3679351/28-13 (22) 14.12.83 (31) 83101035. 0 (32) 03.02.83 (33) FP (46) 07.05.89. Бюл. Р 17 (71) Адзиномото Ко, Лтд, Джапаниз

Фаундейшн Фор Кэнсер Рисерч (ЗР) (72) Гадатсугу Танигути, Иасами Мураматсу, Харуо Сугано,. Хироси Иатсуи, Нобуказу Касима и Дзунди Камуро (JP) (53) 575.?24.2; 557.2(048)(088.8) (56) Gillis et al. 3. Immunol, 1980, V. 125, Р 6, р. 1709-1719.

Изобретение относится к генетической инженерии и касается способа получения интерлейкина-2 человека в клетках бактерий Escherichia coli

Целью изобретения является повышение выхода интерлейкина-2.

Повышение выхода белка в клетках

Е. coli обеспечивается за счет того, что конструируют рекомбинантные плазмидные ДНК pTI of.2-22, pTU-I of.2-22, pGI oL 2-22, pTI oL 2-2la, pTI of. 2-21b кодирующие синтез интерлейкина-2, полученными плазмидами трансформируют бактериальные клетки Е. coli.

Пример 1. Линию клеток лейкемии Т человека, клетки Джуркат суспендируют в среду RPNI 1640, содержащую 10Х (об./об.) FC8, и получают

„„SU „„1479005 А 3

151) 4 С 12 N 15/00, С 12 Р 21/00 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНТЕРЛЕЙКИНА-2

ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к области генетической инженерии и касается способа получения интерлейкина-2 человека в клетках бактерий Escherichia

cali. Целью изобретения является повышение выхода интерлейкина-2, Повышение выхода белка в клетках Fscherichia coli обеспечивается за счет того, что конструируют рекомбинантные плазмидные ДНК pTI оС 2-22, pTUI

Ы 2-22, pGI о 2-22, pTIK 2-21а, pTI of. - 2-21Ь, кодирующие синтез интерлейкина-2, полученными плазмидами трансформируют бактериальные клетки

F.. coli ° 3 табл.

И

2 рентгеновскими лучами до 10000 Р, при комнатной температуре в течение

50 с. Затеи клетки, подвергнутые об- М лучению, культивируют.в течение 5 дней CO при 37 С в инкубаторе, содержащем 5Е ()

СО, при начальной плотности клеток (»

1х10 кл./мл. Клетки после обработки ф мутагеном (0,2 кл./углубление) помещают в углубления 10 микропластинок, имеющие плоское дно, причем каждая .микропластинка имеет 96 углублений, )р о . и культивируют при 37 С в инкубаторе, содержащем 5Х СО, в течение 21 дня.

Клоны, полученные в углублениях и проявляющие тенденцию к росту, пов-, торно переносят в свежую культуральную среду с целью увеличения размера клона и размноженные клоны культиви1479005 руют в течение 24 ч при начальной плотности клеток 1х10 кл./мл в присутствии 50 мкг/мл К0Н А, измеряют активность интерлейкина-2 (ИЛ-2).

Затем линию Т-клеток человека, обозначенную как Джуркат Т?Т (J — III) и клонированную из клетки-родителя

Джуркат, выделяют. В результате этогсвыход ИЛ-2 увеличивается в 40 раз по сравнению с родительскими клетками.

Линию I-III клонированных клеток выращивают при известных условиях, и скорость их роста почти та же, что и у обычных клеток Джуркат.

Клетки (1х10 кл./мл) J-III nepe5 вивают в 1000 мл синтетической культуральной среды, RITC 55-9 в роликовой колбе для выращивания культур и культивируют в течение 4 дней при 2р о

37 С, клетки после размножения собирают путем центрифугирования, Собранные клетки снова превивают в среду, в которую добавляют 25 мкг/мл

КОН А с тем, чтобы плотность клеток 25

6 . составила 4х10 кл. /мл. Используют четыре роликовые колбы для выращивания, причем в каждую колбу загружают

1000 мл привитой культуральной среды, Культивирование продолжают в течение 3р

6 ч при вращении колб.

Клетки Джуркат (1,2х10 ), стиму6 лированные 25 мкг/мл КОН А в течение

6 ч, суспендируют в 8000 мл фосфатного буфера, сбалансированного соляным раствором. Клетки npoMblBafoT дважды с помощью центрифугирования и вновь суспендируют в 800 мл раствора RSB (10 ммоль трис-НС1, рН 7, 5; 10 ммоль/

NaCl; 1,5 ммоль MgC1 ), содержащего 40 комплекс Ринуклеозиды-Ванадил (1 0 мИ) в качестве ингибитора нуклеазы. Затем добавляют детергент NP-40 таким образом, чтобы его конечная концентрация составила 0,057.; содержимое 45 энергично перемешивают, а ядра клеток удаляют с помощью центрифугирования в течение 5 мин со скоростью

3000 об/мин при 4 С. В верхний слой добавляют SDS (0,57) и ЗДТК (5 ммоль) и цитоплазматическую PHK экстрагируют добавлением равного объема фенола.

После трехкратного экстрагирования фенолом РНК осаждают двумя объемами этанола и осадки собирают с помощью центрифугирования, затем их растворяют в 10 ммоль трис-НС1 при рН 7,5.

Количество полученной РНК составляет

196 мг.

Фракционирование иРНК осуществляют с использованием хроматографии на олиго (дТ) -целлюлозе. Раствор абсорбции — раствор при рН 7,5, содержащий

20 ммоль трис-НС1, 0,5 моль NaCl, 1 ммоль ЗДТК и 0,5X SDS, а элюирование осуществляют водой и 10 ммоль трис-НС1 (рН 7,5) по очереди после промывки колонны буфером (20 ммоль трис-НС1, рН 7,5; 0,5 ммоль МаС1;

1 ммоль ЗДТК). В результате элюирования получают 3,6 мг иРНК, Затем

2,4 мг полученной иРНК фракционируют с помощью центрифугирования в градиенте плотности сахарозы (градиент плотности сахарозы от 5 до 2,5 в растворе с рН 7,5, содержащем 50ммоль трис — HC1 1 ммоль ЭДТК и 0, 2 моль

NaC1), подвергают центрифугированию со скоростью 26 000 об/мин в течение

24 ч при 4 С, и фракции с 11 по 12С иРНК подвергают фракционированию на фракции Р 12, 13 и 14 в количестве

59; 46 и 60 мкг соответственно.

PHK полученную во фракции Ф 13, вводят в форме микроинъекции в овоцит Xenopus lalvis (50 нг иРНК/яйцеклетки) и культуральный верхний слой используют для анализа активности ИЛ-2.

Как показано в табл. 1, увеличение полученной дозы Н-ТДР и увеличение количества активированных Тлимфоцитов согласуется, что указывает на то, что иРНК в этой фракции содержит ИЛ-2 иРНК человека.

Далее кДНК синтезируют в лабораторных условиях из фракции Р 13 с.

11-12С иРНК, содержащей ИЛ-2 иРНК, и рекомбинантную ДНК строят с помощью вектора плазмида pBR 322. С помощью рекомбинантной ДНК трансформируют кишечную палочку Fscherichia

coli и клон, содержащий клоны ИЛ-2 кДНК, изолируют следующим образом:

50 ммоль трис-НС1 буфера (рН 7,5), -30 ммоль NaC1, 6 ммоль ИяС1, 5 ммоль дитиотрейтола (ДТТ), 0,5 ммоль каждого из дАТФ, дГТФ, дПТФ, дТТФ (дЦТФ состоит из радиомеченого "Р дЦТФ), 0,7 мкг олиго (дТ)„д, 10 мкг иРНК и 15 ед, А1"Ж обратной транскриптидазы смешивают и поддерживают в течение 90 мин при 41 С.

После завершения реакции ДНК извлекают в виде этаноловых осадков после обработки фенолом, а затем ДНК растворяют при рН 7,5. в растворе

5 147 содержащем 20 ммоль трис-НС1 и 1 ммоль

ЭДТК. В результате синтезируют

2,5 мкг он-кДНК. Чтобы удалить иРНК, содержащуюся в этом растворе, приготавливают 0,33 н. раствор NaOH путем добавления NaOH, затем раствор выдерживают в течение 15 ч при комнатной температуре и нейтрализуют равным объемом 1 M трис-НС1 при рН 7,5. Далее полученный раствор пропускают через колонну "Сефадекс С-50". Всего получают 1,8 мкг кДНК.

50 ммоль фосфатного буфера (рН 7,5)

?О ммоль MgC1<, 10 ммоль ДТТ, 0,75 ммоль каждого из дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ (дЦТФ состоит из радиомеченого Н дЦТФ), 1,8 мкг он-кДНК и

8 ед, полимеразы I смешивают в течео ние 15 ч при 15 С. После завершения реакции ДНК извлекают в виде этанолового осадка после нескольких обработок фенолом и хлороформом. Образуется 1,10 мкг дн-кДНК. Смесь 50 ммоль ацетата натрия (рН 4,5), 0,2 ммоль

NaC1, 1 ммоль ZnC1 и 1,10 г дн-кДНК инкубируют в течение 20 мин при 37 С

) затем в нее добавляют 0,25 ед. нук= леаэы S„è смесь инкубируют еще в течение 15 мин.

После завершения реакции полученный продукт дважды обработанный фе) иолом, пропускают через "Сефадекс

G-50", в результате чего получают

0,55 мкг дн-кДНК.

Смесь 0,14 моль какодилата калия, 30 ммоль трис-основания, 0,1 ммоль

ДТТ, 1 ммоль СоС1, 0,64 ммоль РдЦТФ (уд. активность 2, 7хl О о тсчетов мин нмоль ), 0,55 мкг дн-кДНК и

5 ед. терминальной трансферазы инкуо бируют в течение 7 мин при 37 С, затем пропускают через нСефадекс С-50 после обработки фенолом, чтобы получить 0,50 мкг ДНК в виде этаноловых осадков. Извлеченная ДНК содержит примерно 50 дЦМФ-остатков на обоих

3 -терминалах.

10 мкг плазмиды pBR 322 ДНК рассекают ферментом сечения Pst I и к

3 -терминалам рассеченной ДНК добавляют дГМФ-цепь с использованием того же метода, что при добавлении дЦМФ к дн-кДНК за исключением того, что вместо дЦТФ используется дГТФ.

Смесь 50 ммоль трис-НС1 (рН 7,5), 0,1 моль NaC1, 5 ммоль ЭДТК, 0,05 мкг

pBR 322, удлиненного дГМФ-остатками, и 0,01 г кДНК, удлиненной дЦМФ, ин9005

1О

55 кубируют сначала в течение 2 мин при и

65 С, затем в течение 20 мин при о и

46 С, в течение 60 мин при 37 С и в течение 60,мин при комнатной температуре.

E. coli Х 1776 прививают в 50 мл

Л-бульона, содержащего 100 мкг/мл диаминопимелиновой кислоты, 50 мкг/мл тимидина, l триптофана, 0,5i экстракта дрожжей, 0,57 NaC1 и 0,17 глюкозы, и культивируют при встряхивании при 37 С до тех пор, пока поглощение культуральной жидкости в области

562 нм не даст оптическую плотность

0,3. После завершения культивирования культуральную жидкость выдерживают при О С в течение 30 мин, затем бактериальные клетки собирают с помощью центрифугирования, промывают дважды

25 мл раствора, содержащего 5 ммоль трис-НС1 (рН 7,6), 0,1 моль NaC1, 5 ммоль М8С1 и 10 ммоль RbC1.

Полученные таким образом клетки суспендируют в 20 мл раствора, содержащего 5 ммоль трис-НС1 (рН 7,6), 0,25 моль КС1, 5 ммоль МеС1

0,1 моль СаС1 и 10 ммоль RbC1, и о выдерживают при О С в течение 25 мин.

Далее клетки собирают и вновь суспендируют в 1 мл того же раствора. Затем описанную выше рекомбинантную ДНК добавляют в 0,2 мл суспензии клеток и о суспензию выдерживают при О С в течение 60 мин. В культуру добавляют

0,7 мл Л-бульона и смесь .инкубируют при встряхивании в течение 30 мин и при 37 С. Полученную таким образом куль туральную среду (О, 1 мл) равномерно распределяют на поверхности среды, содержащей 1,5 arapa, состоящей из Л-бульона, содержащего

100 мкг/мл диаминопимелиновой кислоты, 50 мкг/мл тимидииа и 15 мкг/мл о тетрациклина, и инкубируют при 37 С в .течение 2 дней.

Образующиеся в результате 432 колонии разделяют на 18 групп, каждая из которых содержит 24 различных бактериальных клона, прививают в 200 мл

Л-бульона, содержащего 100 мкг/мл ди аминопимелиновой кислоты, 50 мкг/мл тимидина и 10 мкг/мл гетрациклина, и культивируют при встряхивании при

37 С в течение 5 — 7 ч. Затем 200 мл свежего Л-бульона, содержащего хлор-. амфеникол с концентрацией 170 мкг/мл, добавляют в культуру и культивироваI ние продолжают еще в течение ночи.

Полученную таким образом после амплификации дНК-плаэмиду подвергают очистке с использованием известных средств. Клоны, содержащие кДНК ИЛ-2, отбирают с помощью аналитического метода гибридизации - трансляции иРНК (à — Т-анализ).

Г-Т-анализ осуществляют следующим образом. 10

Очищенную ДНК (25 мкг) рассекают ферментом рестрикции Hind III обрабатывают три раза фенолом, смесью фенол — хлороформ и хлороформом соответственно, осаждают этанолом, промыва- 15 ют этанолом (80 ) и растворяют в

40 мкл .80 .-ного формамида.

Затем реакционную смесь нагревают с целью денатурирования до температуо ры 90 С, которая поддерживается 5 мин, 20 разбавляют 1,3 мл с 10 х ССЦ (1,5 моль

NaC1, 0,15 моль цитрата натрия). Далее ДНК фиксируют на нитроцеллюлозных фильтрах, фильтраты сушат при о до 80 С в течение 3 ч и инкубируют в течение 18 ч при 37 С в растворе, содержащем 50 формамида, 20 ммоль

Pipes (рН 6,5), 0,75 моль NaCl, 5 ммоль ЭДТК, 0,2 SDS и 250 мкг. поли(А) иРНК, полученной из индуциро- 30 ванных J-III клеток, с целью получе, ния гибрида ДНК, зафиксиров анной на фильтрах, с ИЛ-2 иРНК. Затем фильтры. о промывают.. при 65 С три раза раствором, содержащим 10 ммоль Pipes (рН

6,5), 0,15 моль NaC1 1 ммоль Pipes, . 10 ммоль Na Cl, и о браб атывают

0,5 ммоль ЭДТК, 0,1%-ным раствором

SDS при 95 С в течение 1 мин с тем, чтобы извлечь с фильтров гибридизи- 40 рованную иРНК. Экстрагированную таким образом иРНК подвергают очистке на колонне из олиго-дТ-целлюлозы в соответствии с известными методами

I и инъецируют .в овоциты Xenopus с 45 целью определения активности ИЛ-2 транслированных протеинов. Одна из

18 групп, каждая из которых состоит из 24 клонов, дает положительную активность ИЛ-2 48 ед./мл в испыта9 нии на поглощение Н-ТдР в то время ! как другие группы дают четкий отрицательный результат.

Затем 24 отдельные колонии, принадлежащие положительной группе, при" 55 вивают в 200 мл Л-бульона, культивируют в аэробных условиях в течение

5-7 ч при 37 С и добавляют свежий

Л-бульон, содержащий хлорамфеникол.

После амплификации ДНК-плазмиды в процессе культивирования в течение ночи пла зм иду п одве рг ают о чис тк е в соответствии со стандартными процедурами. По сле р ас с еч ения и риме рно

5 мкг каждой ДНК-плазмиды с помощью

Hind III каждую ДНК-плазмиду фиксируют на нитроцеллюлозных фильтрах.

Фильтры подвергают гибридизации с

ИЛ-2 иРНК.и гибридизированную иРНК извлекают, а затем в виде инъекции вводят в овоцит Xenopus с тем, чтобы определить активно сть ИЛ-2 транслированных протеинов.

Как показано в табл. 2, только

ДНК-плазмица, полученная после очистки из единственной колонии, обозначенная р3-16; дает положительную активность ИЛ-2. Поэтому этот клон идентифицируют как клон, содержащий

ИЛ-2 кДНК (Е. coli Х1776/р3-16, А

Т 11995 (FERM-BP-225) . Таким образом, ДНК-плазмида рЗ-16 действительно содержит ДНК (ген ИЛ-2), способную образовывать специальный гибрид с Ип-2 иРНК. кДНК-вставка плазмиды рЗ-16 обладает такими свойствами, которые псз— воляют рассекать ее ферментом сечения

XbaI в единственном сайте, а ферментом BstNI — в двух сайтах (вверх и вниз от сайта сечения XbaI). Однако плазмида рЗ-16 содержит кДНК-вставку, состоящую из примерно 650 пар оснований, которая соответствует части

ИЛ-2 иРНК с 11-12С.

Поэтому получают другую кДНК-библиотеку, используя ИЛ-2 иРНК в качестве шаблона. Однонитевую кДНК (1,6 мкг) синтезируют с использованием 4 мкг ИЛ-2 иРНК, удлиненной с помощью дЦМФ-остатков а дн-кДНК син7 тезируют с использованием .олиго (дГ)», в качестве затравки для

ДНК-полимеразы I (фрагмента Кленова), кНДНК (0,6 мкг), по длине превьппающую маркер размера ДНК в 680 пар оснований, получают с помощью центрифугирования градиентом сахарозы и вставляют в сайт Pst I плазмиды

pBR322 с помощью стандартного метода отсечения G-С-концов. После трансформации Е. coli Х 1776 с помощью рекомбинантной ДНК отбирают приблизительно 2000 колоний с помощью метода гибридизации На месте с транслированньии концами вставки кДНК р3-16 в качестве зонда, выявляют колонию, со1479005

50 держащую плазмиду pI a 2-50А, размером 850 пар оснований (Е. coli

X 1776/pl îÑ.2-50А, AnL 11996 (ГЕКИ-BP226).

Чтобы изолировать ген, кодирующий

ИЛ-2-пептид, из трансформированной культуры Е. coli Х 1776 pI ьа 2-50А, ДНК-плазмиды обрабатывают с ферментом рестрикции Pst I, выделяют фрагменты ДНК из клеток известными методами. Получающийся таким образом фрагмент меньших размеров среди двух фрагментов ДНК является геном ДНК, кодирующим ИЛ-2-пептид.

Пример 2. Плазмида pKCR состоит из сегментов ДНК вируса

SV 40, содержаших промотор исходного гена, начало репликации (0,725

0,648 м.е.). сайт нолиаденилирования из исходного гена (0,169-0,144 м.е., части гена Р-глобина кролика (фрагмент BamHI-PVU II), сегмента из pBR322 (фрагмент EcoRI-BamHI), содержащего начало репликации и ген стойкости к ампициллину. Эту плазмиду рассекают с помощью BamHI и после заполнения обоих концов рассеченной ДНК ДНК-полимеразой I (фрагмент Кленова) вводят синтетическую ДНК линкера Pst I c тем, чтобы закончить построение pKCR (Pst I). Ппазмиду рКСР (Pst I) рассе° кают ферментом SalI, обрабатывают фрагментом Кленова с целью заполнения концов, а затем частично рассекают ферментом EcoRI с тем, чтобы получить фрагмент EcoRI-SalI который содержит всю ДНК, полученную из вируса

SV 40, и ген глобина. Этот фрагмент затем подвергают лигации с .куском рВК328 ДНК, который содержит ген стойкости к тетрациклину и начало репликации. Полученная в результате плазмида рСЕ-I содержит единственный сайт Pst I в направлении вниз сразу после полученного ранее промотора

SV 40.

Вставку кДНК-плазмиды pl 2-50А отсекают путем рассечения ферментом

Pst I и подвергают лигации с рСЕ-I, 1 рассеченным Pst I, с целью построения

pCEI ol, 2, в котором экспрессия структурного гена ИЛ-2 должна осуществля-: ться под контролем ранее вставленного промотора SV 40. Плазмида рСЕ-I ранее строилась для клонирования кДНК методом Г-С-концов в бактерии и прямой экспрессии в клетках млекопитающе го °

Эту плазмиду обрабатывают ири помощи Hhal> а затем вводят с пс мощью

ДНК-трансфекции в линию COS-7 транс" формированных клеток обезьяны, которая позволяет осуществить репликацию

ДНК, содержащей начальные последов»тельности вируса SV 40.

Важным этапом является обработка плазмиды с помощью HhaI перед трансфекцией для повышения эффективности экспрессии кДНК, так как последовательности, которые могли бы препятствовать репликации ДНК после трансфек15 ции в COS клетки, удаляют из существенной части плазмиды для =-кспрессии кДНК. Клетки COS-7 (6 х 10 /мл) суспендируют в 0,5 мл ДИЕИ, содержащего

5Е F1S которые находятся на пластине для культивирования с 24 углублениями (типа Нунк), и инкубируют в тече- ние 4 ч при 37 С. Затем смесь 1 мкг описанного выше в екто ра, 17, 6 мкл

1 мИ трис-НС1, содержащего 0,1 ммоль

25 ЭДТК, 2,4 мкл 2И СаС1 и 120 мкл 2 х

x HBS, содержащего 50 ммоль Р рев, 280 ммоль NaC1 и 1,5 ммоль Na

1 о

ЗО в течение 4 ч при 37 С. Культураль ная среда обезвоживается. Затем клетки промывают 1 мл PBS и культивируют, в 1 мл ДИЕИ, содержащем 57 FCS. Каждые 24 ч 500 мл среды заменяют свежей средой. Каждую порцию среды, собранную в определенный момент времео ни, хранят при 4 С до использования.

Спустя 2-3 дня после трансфекции культуральную среду анализируют на активность ИЛ-2 человека.

Как показано в табл. 1, получен» ный в результате верхний слой культуры клеток COS-7 после трансфекции с использованием pCEI<-2, обладает активностью ИЛ-2. Однако в культуральной среде клеток после трансфекции с использованием рСЕ-I активности ИЛ-2 не обнаружено.

Активность ИЛ-2, обнаруженная в культуральной среде клеток после трансфекции клетки COS-7 с помощью рСЕТЫ-2, нейтрализует с помощью моноклонального анти-ИЛ-2 человека антитела мыши (BALB/k) . Тот факт, что

COS-7 клетки после трансфекции с использованием pCEI<-2 секретируют ИЛ-2 человека, показывает, что эукариотические клетки, трансформированные рекомбинантной ДНК, содержащей ген, 1l 14 кодирующий полипептид ИЛ-2, и вектор

ДНК, способный к релликации в указанных клетках, может быть использован для получения KI-2, Пример 3. Escherichia coli

Х 1776/рТЫ 2-50А, А 1 11996/FFRM-ВР226 прививают в 250 мл Л-бульона, содержащего 100 мкг/мл диаминопимелиновой кислоты, 50 мкг/мл тимидина, 1 триптофана, 0,5 экстрактов дрожжей, 0,5 NaC1 и 0,1 глюкозы, и культивируют при встряхивании и температуре

37 С до достижения оптической плотности в области 562 нм культуральной средой 0,5 ° После завершения культиВирования культуральную среду выдерживают при 0 С в течение. 30 мин и клетки собирают с помощью центрифуг иров ания, промывают один раэ

20 ммоль трис-НС1 при содержании

30.ммоль NaC1 и вновь суспендируют в

1, 8 мл того же буфера. Раствор, со1 держащий 0,2 мкл лизоцима (10 мг/мл) и 20 мл 0,5 M ЭДТК, добавляют в,о клетки и смесь выдерживают при 0 С в течение 20 мин, а затем заморажийают — размораживают 3 раза последовательно. Далее экстракты клеток (1,5 мл) получают после центрифугирования со скоростью 40 000 об/мин в течение 30 мин. Экстракт подвергают высаливанию с помощью 85 -ного раствора сульфата аммония, пропускают через "Сефадекс G-15" с целью удаления солей, затем помещают на колонку хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе и фракцию, элюированную с помощью

0,06 M буфера трис-HCl (рН 7,6), собирают. Собранную таким образом фракцию сушат вымораживанием и помещают на стеклянные шарики с определенным а размером пор 250 А, содержащемся в колонне для хроматографии, для анализа активности ИЛ-2 в элюенте с использованием 0,3 M буфера глицин-НС1.

Фракция, содержащая ИЛ-2, обладает активностью ИЛ-2 12 ед./мл. Полученные результаты указывают на то, что

Е. Cali Х1776/pI Ы. 2-50А, AT 11996 ,цействительно производит ИЛ-2.

Пример 4. Конститутивную линию клеток-производителей ИЛ-2 типа Т-А1886 (АТСС CPL 8130) выращивают аналогичным образом в роликовой колбе для культуры. Выращенные клетки суспендируют в свежую синтетическую среду RITC-55-9 при начальной б плотности клеток 1х10 кл. /мл и спус79005 12

ЗО

55 тя 8 ч после начала культивирования клетки используют для экстрагирования ИЛ-2 иРНК в виде фракции 11 — 12С.

Синтезируют двунитевую кДНК, а кДНК длиной, превыаающей 600 пар оснований (2,4 мкг), получают после фракционирования с использованием градиента плотности сахарозы, кДНК затем удлиняют с помощью дЦМФ-остатков с использованием терминальной деоксинуклеотидилтрансферазы (50 нг), ее подвергают ренатурации с 250 мг плазмиды pBR322, удлиненной с помощью дГИФ и рассеченной с помощью Pst

Полученные в результате гибридные плазмиды используют для трансформации Е. coli Х 1776, в результате чего получают примерно 4000 трансформированных клонов. Отбирают три клона, комплементарных с кДНК плазмиды р3-16, которая используется в качестве зонда.

Пример 5. Плазмиду, которая кодирует синтез ИЛ-2 человека в кишечной палочке Е . coli строят следующим образом. Плазмиду рТТ Ы 2-22 строят из pTr S-3 и pIЫ2-50А, содержащей кДНК ИЛ-2. Плазмида pTr S-3 содержит вставку области промотора

Trp и Шайи Далгарно (Shine Dalgarno—

SD) между сайтом EcoRI и сайтом ClaI плазмиды pBR 322. Кроме того, эта плазмида содержит кодон ATG в 13 п.о. расположенный вниз от SD-последовательности, а также единственный сайт

Sph I. Этот вектор является эффективным для продуцирования указанного протеина, если ДНК-последовательность, соответствующую указанному протеину, вставляют в область, расположенную в направлении вниз сразу же после кодона ATG, которая образуется в результате SphI ферментации и последующей обработки при помощи ДНК вЂ” полимеразы

Т4 плазмиды pTr $-3. Плазмиду pTr S-3 (30 мкг) рассекают ферментом сечения

Sph I известными методами и после серии обработок фенолом и хлороформом этаноловые осадки извлекают, затем оба конца снабжают "наплывом" путем обработки ДНК-полимеразой Т4. Далее

ДНК (21,4 мкг) извлекают путем аналогичной обработки фенолом, хлорофор

МоМ и осаждения этанолом. С другой стороны, 380 мкг плазмиды р?о 2-50А, содержащей кДНК ИЛ-2, рассекают с помощью фермента Pst I и ИЛ-2 кДНКвставку изолируют с помощью электро13

1 479005 фореза на агаровом геле. кДНК-вставку (11 мкг) рассекают с помощью Hgi

AI обрабатывают с помощью ДНК-полимеразы Т4 и 10 мкг ДНК больших размеров изолируют с помощью электрофореза на агаровом геле. Получают кДНК (7,2 мкг), содержащую информацию относительно синтеза 132 аминокислот, причем этот фрагмент ДНК имеет тупые концы.

Затем полученный таким образом фрагмент кДНК сшивают с вектором

pTr S-3, предварительно подвергнутьм ферментации с использованием Sph I u обработанным ДНК-полимеразой Т4, в точке, расположенной в направлении вниз сразу после ATG-последовательности. Сшитую таким образом плазмиду затем используют для трансформации клеток Е. со 1 HBIOI известными методами.

Сшивку осуществляют следующим образом. Более длинный фрагмент кДНК

ИЛ-2 (0,4 мкг) и 0,2 мкг ДНК вектора

pTr S-3 смешивают с 0,8 ед. ДНК-лигазы Т4 в 66 ммоль трис-НС1 при рН 7,5 при содержании 6,6 ммоль MgC1

1 ммоль АТФ и 1О ммоль ДТТ. Смеси дают возможность взаимодействовать при 4 С в течение ночи. Среди трансформированной культуры, образующейся на агаровой пластине с Л-бульоном, содержащим ампициллин, отбирают коло— нии, содержащие порцию ИЛ-2 кДНК, которая включает информацию относительно

132 аминокислот. Такую селекцию осуществляют на месте аналитическим методом гибридизации колоний. Выбранные таким образом колонии культивируют (lО мл), чтобы получить ДНК-плазмиды в результате обработки лизоцимом и замораживания-размораживания. ДНКплазмиды рассекают с помощью Pst и XbaI и полученные,в результате продукты подвергают анализу с помощью электрофореза на агаровом геле, чтобы идентифицировать pTIос 2-22, в кото, ром кДНК сшита с ATG — последовательностью плазмиды pTr S-З с правильной ориентацией. Е. coli HBIOI, содержащую pTIK 2-22, выращивают при стандартных условиях, которые используют для размножения микроорганизмов.

Клетки выращивают в 1О мл X — бульона (2,57. бактотриптона, 1,ОЯ экстрактов дрожжей, О, 1% глюко зы, 20 ммоль

MgSO4, 50 ммоль трис-НС1, рН 7,5), содержащего 25 мкг/мл стрептомицина и 25 мкг ампициллина при 37 С в течг ние ночи, Суспензию объемом 1 мл культуры прививают на том же бульоне (100 мл) и культивирование осуществляют при

37 С. Когда оптическая плс тность достигаетт приме рно 1, 5-2, О, добавляют

3-индолакриловую кислоту (ИАК), Спу10 стя 3 ч после добавления пндуктора клетки собирают, промывают 20 ммоль трис-НС1 (рН 7,5 „30 ммоль 11аС1) и вновь суспендируют в 8 мл того же буфера. Для эффективного фунхциониро15 вания промотора Тгр такой индуктор, как ИАК, доб авляют так, что бы его конечная концентрация составила

50 мкг/мл. Полученные таким образом в бактериальных клетках протеины экс20 трагируют в результате обработки ультразвуком (О С, 2 мин) или в результате ферментации лизоцимом 8 мкг/л (О С, 20 мин) и осуществляют трижды последовательно замораживание-размораживание. В соответствии с этими процедурами ИЛ-2 в общем случае экстрагируется из организмов, Активность экстрагированного ИЛ-2 изменяется в области 10000 — 120000 ед./мл.

30 Пример 6. Плазмиду pTUIeC

2-22, несущую ИЛ-2 кДНК, строят из

pTUBIP-5 и pTI oh,2-22. Плазмида рТ рТ11ВIF-5 включает вставку про»оторной последовательности tufB в pBR 322.

Кроме того, плазмида содержит единственный сайт Clal, и он расположен вниз на 2 п.о. от SD-последовательности. Так как pTr S-3 кроме того, содержит сайт Clal между SD-последова40 тельностью и кодоном ATG инициирования и так как этот сайт Clal не разрушается в процессе конструкции плазмиды экспрессии с использованием pTr

S-3 и кДНК ИЛ-2, бактериальный про45 мотор trp просто заменить промотором

tufB так, что ИЛ-2 кДНК подвергается экспрессии при управлении промотором сийВ.

Поэтому плазмиду pTI 2-22 (30 мкг)

50 рассекают ферментами рестрикции ClaI и PVU II с использованием стандартных процедур. Фрагмент (2, 2 1 Ь), содержащий кДНК ИЛ-2, изолируют и подвергают очистке с помощью электрофореза

55 на агаровом геле, в результате чего получают 3 мкг ДНК. С другой стороны, 20 мкг вектора pTUBIP-5 рассекают аналогичным образом с помощью Clal u

PVU III и больший фрагмент (3,4 1cb) 1479005

15 содержащий ген стойкости к ампициллину, изолируют и подвергают очистке с помощью электрофореза на агаровом геле, чтобы извлечь 3, 5 мкг ДНК.

Затем полученные таким образом два фрагмента, один из которых (3,4 kb) содержит промотор tufB, а другой (2, 2 kb) — кДНК ИЛ-2, подвергают лигации, которую осуществляют следую- 10 щим образом. Фрагмент, содержащий кДНК ИЛ-2 (1,2 мкг) и 0,3 мкг фрагмента, содержащего промотор tufB, смешивают с 0,8 ед. ДНК-лигазы Т4 в 66 ммоль трис-НС1 (рН 7,5) при ñîдержании 6,6 ммоль ИРС1<, 1 ммоль

АТФ и 10 ммоль ДТТ, и смеси дают воэможность взаимодействовать при о

4 С в течение ночи. Эту плазмиду после лигации используют для трансформации кишечной палочки. Е. coli

HBIOI в соответствии со стандартными процедурами. Среди трансформированных клеток, образующихся на агаровой пластинке с Л-бульоном, содер- 25 жащим ампициллин, отбирают восемь колоний, содержащих порцию кДНК ИЛ-2 такую, как pTUI <2-22 и получают ДНК. плазмиды. Клетки Е. col i HBIOI, со: держащие рТ1П Ы.2-22, культивируют в Л-бульоне (100 мл) при 37 С. Когда оптическая плотность в области 650 нм достигает примерно 0,5-.1,0 бактериальные клетки собирают, промывают

20 ммоль трис-НС1 (рН 7,5; 30 ммоль

NaC1) и вновь суспендируют в 2 мл того же буфера. Полученные таким образом протеины экстрагируют. Активность экстрагированного ИЛ-2 изменяется в области 6000 — 56000 ед/мл. 40

Пример 7. Плазмиду pGI

2-22, несущую кДНК ИЛ-2, строят из рСой0? и TI о(2-22 .

Плазмиду рСо 101 (20 мкг), содержащую промотор lac, рассекают фер- 45 ментом сечения PVU II стандартным методом, чтобы получить 17 мкг ДНК путем последовательной обработки фенолом, хлороформом и осаждения этанолом. С другой стороны, pTIoC 2-22 б0 (75 мкг) рассекают с помощью ClaI u

SalI,ñ тем, чтобы извлечь 2,2 мкг фрагмента ДНК, содержащего кДНК ИЛ-2 с помощью электрофореза на агаровом геле. Этот фрагмент снабжают "наплывом" путем обработки ДНК-полимеразой

I (фрагмент Кленова), затем полученные таким образом два фрагмента (0,25 мкг и 0,66 мкг) подвергают лигации с 1,0 ед. ДНК-лигазы Т4. Полученную таким образом после лигации плазмиду зятем используют для трансформации клеток F.. coli HBIOI no стандартной методике.

Среди трансформированных клеток отбирают клетки, содержащие вставку фрагмента ClaI — $аП, включающего кДНК 1 .Л-2. Эти трансформированные клетки затем культивируют в Х"бульоне (10 мл), содержащем 26 мкг/мл ампициллина, получают ДНК-плазмицы.

ДНК-плазмиду, содержащую последовательность АТС инициирования кДНК ИЛ-2 в направлении вниз сразу же после промотора lac, получают путем рассечения с использованием ферментов:

Pst I u XbaI.

Полученную таким образом плазмиду

pGI < 2-22 помещают в 100 мл Л-бульона, содержащего 25 мкгlмл ампициллина и 25 мкг/мл стрептомицина, и затем культивируют. Когда оптическая плотность в области 650 нм достигает примерно 0,5, добавляют изопропил-1о-D-тиогалактопираноэид (ИПТГ) концентрации 1 MN, а спустя 1 ч бактериаль ные клетки собирают. Активность экстрагированного ИЛ-2 изменяется в области 6000 — 80000 ед./мл.

Пример 8. Плаэмиду pTr $-3 (10 мкг) сначала рассекают ферментом расщепления SalI и сайт SalI снабжают "наплывом" путем обработки ДНКполимеразой (фрагмент Кленова) или

ДНК-полимеразой Т4. После рассечения ферментом ClaI больший фрагмент, соr держащий область промотора trp, изолируют с помощью электрофореза на агаровом геле с использованием стандартных методов, в результате чего получают 3 мкг ДНК.

11 мкг кДНК-вставки, полученной в результате сечения ферментом Pst I плаэмиды pIK 2-50 А, рассекают с помощью Hgi AI, обрабатывают ДНК-полимеразой Т4 и больший фрагмент изолируют и подвергают очистке с помощью электрофореза на агаровом геле . Таким образом, фрагмент кДНК, содержащий информацию о 132 аминокислотах

ИЛ-2, получают в количестве 7,2 мкг.

Затем 0,45 мкг фрагмента, содержащего промотор trp, 0 5 мкг фрагмента

HgiAI-Pst I, содержащего кДНК ИЛ-2 и синтетические олигонуклеотиды (5 )CG

II

АТАА G CTATGG СА(3 ) и (3 ) ТАТТС С

ATACCGT(5 ) каждого по 20 на 1 моль, 79005 l8

Л-бульоне при 37 С, чтобы получить сосоответствующие рекомбинантные ДНК в трансформированных клетках, и отделения штаммов, которые становятся чувствительными к тетрациклину и ампициллину, в качестве кле ток-хозяев.

17 14 каждый из которых фосфорилирован в

5 — терм ин але, подв е рг ают лиг ации с

1 ед. ДНК вЂ” лигазы Т4.

Полученную таким образом после лигации плазмиду затем используют для трансформации клеток Е. coli

HBIOI. Среди образующихся трансформированных клеток искомые трансформированные клетки отбирают следующим образом.

Сначала отбирают в качестве кандидатов трансформированные клетки, способные к гибридизации как с кДНК

ИЛ-2>так и с синтетическими олигонуклеотидами (эту процедуру осуществляют с использованием метода гибридизации колонии). Затем с помощью сечения ферментами Pst I, Xbal отбирают трансформированные клетки, содержащие вставку фрагмента ДНК, начинающегося с ССТ-последовательности в позиции с

III по 113 ССТАСТ вЂ” в направлении вниз сразу же после AT GG СА-последовательности.

Трансформированные клетки после селекции культивируют Л-бульоне, при этом высокую активность ИЛ-2 устанавливают в экстрактах клеток.

Результаты исследований приведены в табл. 2 и 3.

Клетки-хозяева Е. coli 1776 и

HBIOI которые использовались, получены из сданных на хранение трансформированных клеток с помощью культивирования трансформированных клеток в

Та бл ица 1

Рост Тлимфоцитов

ДНК, при помощи которой осущест вляется транс30 фекция

Актив но сть

Н-TdP, ед./мл р СЕ Хы.-2 рСЕ-I

35

Таблица 2

Разбавление Содержание з Н ТДР отсче» тов/мин

Проба личество

-2, ед./мл

2 х 2

553

590

572

14683

10165

0 х 3

13х8 х 32 х 2 х 16 х 2

115

55 х 16 х 2 х 16

Контрольная I (среда для анализа)

Контрольная II (верхний слой культуры необработанных яйцеклеток)

Продукт трансплантации фракции

Контрольная I (среда для анализа)

Контрольная II (верхний слой необработанной культуры яйцеклето к)

Про дук т трансплантации фракции 13

Формула изобретения

Способ получения интерлейкина-2 человека, предусматривающий культивирование клеток в среде с последующим выделением и очисткой полученного

15 продукта, о тлич ающийся тем, что, с целью повышения выхода интерлейнина-2, штамм бак териальных клеток Escherichia coli трансформируют рек омбинантной плазмидной ДНК

20 рТТос,2-22 или pTUI oL2-27,, или pGI<

2-22, или рТ?й, 2-21а, или pTI <2-2ib, содержащей вставку, кодирующую интерлейк ин-2.

20

1479005

Таблица 3

Проба

Разбавление Содержание

Количество

ИЛ-2, ед. /мл

Н-ТдР, отсчетов/мин

Контрольная I (среда для анализа)

Контрольная II (верхний слой жидкой культуры необработанных яйцеклеток)

Продукт трансляции иРНК иРНК .

Контрольная I (среда для анализа)

Контрольная II (верхний слой жидкой . культуры необработанных яйцеклеток)

Продукт трансляции и PHK

2120 х 2

2482

20458

2096) 0 х 32 х 2 х 32

0 х 2 х 32 х 2 х 32

88

32

Составитель Н. Кузенкова

Редактор B. Петраш Техред Л.СердюковаКорректор С. Шекмар

Заказ 2378/58 Тираж 501 Подписное

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

f BHHHIIH Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5