Способ получения копропорфирина ш

Способ получения копропорфирина ш

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности. Цель изобретения - ускорение биосинтеза. Сущность способа сводится к тому, что продуцент ARTHROBACTER GLOBIFORMIS выращивают в питательной среде, содержащей, мас.%: глюкоза 0,5-1,5

аммоний сернокислый 0,05-0,15

питательная основа 2,0-9,0 и вода остальное. В качестве питательной основы может быть использован кукурузный экстракт (5-6 мас.%) либо смесь кукурузного экстракта (1-6 мас.%) с молочной сывороткой или гидролизатом оболочек БВК (1-3 мас.%). Культивирование ведут до 12 сут, затем отделяют мицелий и целевой продукт извлекают из фильтрата культуральной жидкости.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ.

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„80„„4 2 46 (51) 4 С 12 P 1/04, 17/16 //

// (С 12 Р 1:04; С 12 Р 1:06) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЭОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМЪ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

2 (57) Изобретение относится к микробиологической промышленности. Цель изобретения — ускорение биосинтеэа.

Сущность способа сводится к тому, что продуцент Arthrobacter globiformis выращивают в питательной среде, содержащей, мас.%: глюкоза 0,5-1,5; аммоний серно-Kacnsdl 0,05-0, 15; питательная основа 2,0-9,0 и вода остальное. В качестве питательной основы может быть использован кукурузный экстракт (5-6 мас.%) либо смесь кукурузного экстракта ($-6 мас.%) с молочной сывороткой или гидролизатом оболочек БВК (1"3 мас.%) ° Культивирование ведут до 12 сут, затем отделяют мицелий и целевой йродукт извлекают из фильтрата культуральной жидкости.

1 (21) 4187258/31-13 (22) 30.01.87 (46) 30.05.89. Бюл. й" 20 (71) Институт биохимии им. А.Н.Баха и Московский институт тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова .(72) В.Я.Быховский, В.И.Зайцева, В.П.Радина, А.А.Дмитровский, А.Ф.Миронов, В.Д.Румянцева, М.А.Кулиш и А.Д.Сочнев (53) 615.7 (088.8) (56) Быховский В.Я., Зайцева З.И., Полулях О.В. Микробиологический синтез порфиринов. М.: ВНИИСЭНТИ, 1985.

Патент ФРГ В 3044969, кл. С 12 И 1/20, опублик.. 1983. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОПРОПОРФИРИНА III

Изобретение относится к микробиологической промьппленности и касается получения копропорфиринов.

- Цель изобретения - ускорение биосинтеза.

Способ осуществляется следующим образом.

Для выращивания Arthrobacter glo :ЬЫогшхв используют питательную среду, содержащую, мас.%: глюкоза 0,5-:

1,5, серно-кислый аммоний 0,05-0,15,. питательная основа 2;0-9,0 и вода, рН 7,0-7,2. В качестве питательной основы применяют кукурузный экстракт (5-6 мас.%) или смесь кукурузного экстракта с сухой молочной сывороткой или гидролизатом оболочек белкововитаминного концентрата (БВК). В смеси концентрация кукурузного экст:ракта составляет 1-6 мас.%, а кон- 4 центрация сыворотки или гидролизата 00 оболочек БВК 1-3 мас.% от объема сре- Ю ды. Выращивание вепут в аэробных CO условиях, t 28-30 С, в течение « йЬ

4-12 сут.

По окончании культивирования биомассу клеток отделяют на центрифуге или сепараторе, а накопившийся в фильтрате культуральной жидкости копропорфирин III адсорбируют на тальке. Тальк отфильтровывают, про- Э мывают подкисленной водой с рН 3,0 и копропорфирин III Мпоируют смесью ацетон — 1 н. НС1 (9:1 об/об). Ацетон отгоняют в вакууме и доводят рН водного раствора копропорфирина III

3 148294 до 4,6. Выпавший осадок копропорфи. рина Ш отделяют фильтрованием, промывают дистиллированной водой и высушивают в эксикаторе над концентри5 рованной серной кислотой, этерифицируют смесью метанол-концентрированная серная кислота (95:5 об/об), извлекают хлороформом и очищают на

° колонке с окисью алюминия третьей степени активности (проявитель хлороформ). Растворитель удаляют упариванием в вакууме, а осадок перекристаллизовывают из смеси .хлороформметанол (1:5 об/об). и получают це- 15 левой продукт в форме тетраметилового эфира.

Способ обеспечивает получение

60-240 мг/л тетраметилового эфира копропорфирина III в расчете на культуральную жидкость.

Использование способа иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Готовят питательную среду состава, %: глюкоза 1,0, 25 кукурузный экстракт 5 О, аммоний серно-кислый О, 1, дистиллированная вода остальное. Среду разливают в ка. чалочные колбы на 750 мл до 100 мл среды в каждую колбу и стерилизуют 30 при 0,5 атм в течение 30 мин. По окончании стерилизации колбы охлаждают до комнатной температуры 18"

20 С и инокулируют культурой А.globifornis BEN В-658, поддерживаемой в пробирках на косяках ИПА. Общий объем среды рля выращивания 1,1 л..

Колбы помещают в термостат при

28-30 С и проводят инкубацию в аэробных условиях на качалке при числе 40 оборотов 180 об/мин.

Через 48 ч ферментации в колбы ежедневно вносят глюкозу в виде

50,0%-ного стерильного водного раствора из расчета 1,0% глюкозы.на объем 45 культуральной жидкости, а также доводят рН среды до 7,0-7,2 10,0%-ным стерильным раствором.NaHCO>.

Через 12 сут выращивания ферментационную жидкость объединяют и клетки 50 бактерий отделяют на центрифуге при

6 тыс. об/мин. Получают 1 л густо окрашенного супернатанта. Доводят рН супернатанта до 3,0 добавлением

50,0%-ной уксусной кислоты и вносят в него при перемешивании 200 мл активированной суспензии талька в

3%-ной уксусной кислоте. Суспенэию готовят иэ расчета 2 r талька на б

100 мл кислоты. Полноту адсорбции порфиринов на тальк контролируют спектрофотометрически. Через 1 ч тальк отфильтровывают на воронке

Бюхнера и промывают на фильтре

3,0%-ным раствором уксусной кислоты.

Порфирины элюируют 200 мл смеси ацетон-1 н.НС1 (9: 1 об/об) до прекращения окрашивания элюирующего раствора. Ацетон отгоняют в вакууме и порфирины осаждают из концентрированного водного раствора доведением его рН до 4,6 с помощью 20,0%-ного раствора едкого натра. Через 24 ч осадок порфиринов отфильтровывают на воронке Бюхнера и промывают охлажденной дистиллированной водой с рН 4,6.

Осадок сушат в вакуум-эксикаторе над, пятиокисью фосфора в течение 24 ч, а затем помещают в охлажденную смесь метанол-серная кислота (95:5 об/o6).

Объем этерифицирующей смеси 50 мл.

Через 24 ч этерификации, проводимой при комнатной температуре, разбавляют реакционную массу водой до 100С мл и метиловые эфиры порфиринов извлекают хлороформом (3 раза по 50 мл хлороформа). Хлороформ отгоняют в вакууме до конечного объема 3 мл и хроматографируют порфирины на колонс ке с окисью,. алюминия третьей степени активности (размер колонки 2,5v20 см) элюент хлороформ. Хлороформ отгоняют в вакууме досуха и кристаллизуют пор-„ фирины из смеси хлороформ-метанол (1: 5 об/об) .

Вес полученного продукта 202 мг, т.пл. 152 С. Коэффициенты.малярной экстинкции в хлороформе имеют следующие значения: 400 нм (179>10 ), 499 нм (14 10 ), 532 нм (" 10 )

567 нм (7x10 ), 622 нм (5м10 ).

Пример 2. Ферментацию ведут на среде состава, %: глюкоза 1,5, кукурузный экстракт 6,0, аммоний серно-кисльп 0,15. Продолжительность

12 сут. Остальное, как в примере 1.

Выход копропорфирина III 225 мг/л к.ж.

Пример 3. Ферментацию ведут ,на среде состава, %: глюкоза 1, кукурузный экстракт 1,0, молочная сыво- ° ротка 1,0, аммоний серно-кислый 0,1.

Продолжительность ферментации 4 сут.

Остальное, как в примере 1. Выход копропорфирина Ш 103 мг/л к.ж.

Пример 4. Ферментацию ведут на среде состава, %: глюкоза 1,0, кукурузный экстракт 1,0, молочная

46 б

Пример 12. Ферментацию ведут, как в примере 3, но питательная среда содержит дополнительно 37 гирролизата оболочек БВК. Продолжитель--! ность ферментации 12 сут. Выход копропорфирина ТХТ 230 мг/л к.ж.

Пример 13. Ферментацию ведут, как в примере 1, но концентрация глюкозы составляет 0,57., серно-кислого аммония 0,057. Выход копропорфирина III 195 мг/л к.w..

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет ускорить процесс биосинтеза (до 12 сут. вместо 17 сут по известному способу).

Формула изобре тения

14829 сыворотка 3,0, аммоний серно-кислый О, 1. Продолжительность ферментации 6 сут. Остальное„ как в примере 1. Выход копропорфирина III

120 мг/л к.ж.

Пример 5. Ферментацию ведут на среде состава, 7.: глюкоза 1,0, кукурузный экстракт 1,С, гидролизат оболочек белково-витаминного кон- 10 центрата (БВК) 1,0, аммоний сернокислый — 0,1%. Проролжительность ферментации 6 сут. Остальное, как в примере 1. Выход копропорфирина III .90 мг/л к.ж. 15

Пример 6. Ферментацию ведут на среде состава, %: глюкоза

1,0, кукурузный экстракт 1,0, гидролизат оболочек БВК 3,0, аммоний серно-кислый 0,1. Продолжительность 20 ферментации 6 сут. Остальное, как в примере 1. Выход копропорфирина III

106 мг/л к.ж.

П р и и е р 7. Ферментацию ведут, как в примере 1, но в качестве продуцента используют штамм Arthrobacter globifornis BKM B-66О. Выход копропорфирина 195 мг/л к.ж.

Пример 8. Ферментацню ведут, как в примере 1, но в качестве про- 30 дуцента используют штамм Arthrobacter

globifornis ВКМ В-661. Выход копропорфирина III 180 мг/л к.ж.

П ф и м е р 9. Ферментацию ведут на среде состава, 7.: глюкоза 0,5, аммоний серно-кислый 0,05, кукурузньй экстракт 1, молочная сыворотка 1.

Продолжительность ферментации 4 сут.

Выход копропорфирина III 60мг/л к.ж.

Пример 10. Ферментацию ве- 40 дут, как в примере 3, но питательная среда дополнительно содержит 3% молочной сыворотки. Продолжительность ферментации 12 сут. Выход копропорфирина- III 240 мг/л к.ж. 4g

Пример 11. Ферментацию ведут, как в примере 2, но питательная среда содержит дополнительно 1X гирролизата оболочек БВК. Продолжительность ферментации 6 сут. Выхор 50 копропорфирина III 105 мг/л к.ж.

Составитель

Редактор N.Недолуженко Техред М.Ди

Способ получения копропорфирина Ш путем культивирования продуцента

Arthrobacter globiformis в питательной срере, содержащей глюкозу, пита-. тельную основу, соль аммония и вору, с последующим отделением биомассы и выделением целевого прорукта из фильтрата культуральной жиркости, отличающийся тем, что, с целью ускорения биосинтеза, выращивание осуществляют на среде, содержащей в качестве, соли аммония серно-кислый аммони»» а в качестве питательной основы — кукурузный экстракт или смесь его с сухой молочной сывороткой или гидролизатом оболочек белково-витаминного концентрата при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Глюкоза 0,5-1,5

Аммоний сернокислый 0,05-0, 15

Питательная основа 2-9

Вода Остальное при этом кукурузный экстракт используют в концентрации 5,0-6,0 мас.X а при использовании смеси кукурузный экстракт берут в концентрации 16 мас.Х, молочную сыворотку или гирролизат оболочек белково-витаминного концентрата — 1-3 мас.% от объема среды.

С.Листвинова дык,Корректор С.Не»»мар

Заказ 2785/21 Тираж 500 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб, д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,!01