Питательная среда для выращивания неспоровых бактерий

Питательная среда для выращивания неспоровых бактерий

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в микробиологической промышленности для культивирования неспоровых бактерий. Цель изобретения - удешевление среды, увеличение выхода биомассы и сокращение сроков культивирования. Изобретение заключается в том, что в качестве углерод и азотосодержащей основы питательной среды для неспоровых бактерий, содержащей пептон (0,9-1,1мас.%) и хлористый натрий (0,5-0,7 мас.%), используют кислотный экстрактводородокисляющих бактерий ALCALIDEHES EUTROPHIS ВКМ В-1323 в количестве, обеспечивающем содержание аминного азота от 60 до 240 мг/л. 3 ил. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ.

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

А1 (191 (II) <5П 4 С 12 N 1/20 (С 12 N 1/20, С 12 R1 01) ВСЕСОЮЗНАЯ

ПАЧ11ТИО Tr.ÕÐ1II ÄÙß 1.,, „Г .4

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCKOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4190628/31-13 (22) 04.02.87 (46) 30.06.89. Бюл. 11- 24 (7.1) Институт биофизики СО АН СССР (72) И.Н.Трубачев, И.М.Панькова, Ю.И.Баянов, Н.А.Куркатова и В.П.Цай (53) 577. 15 (088.8) (56) Межиня Г.P., Дунце M.Ý. Новые виды сырья для микробиологических производств. Гл. упр. микроб. промти, отд. НТИ и тех. -экон.исслед. микроб.пром-ти. Сер. П., М., 1978, с.38-46.

ГОСТ 10444.1-75. Консервы. Методь: микроб. анализа. Пит.среды, реактивы, индикаторы.

ГОСТ 20444.2-75. Консервы. Методы микроб. анализа. Выявление коагулаэоположит. стафилококков.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в микробиологической промышленности для культивирования микроорганизмов, требующих для своего роста питальные среды, содержащие мясные экстракты, Цель изобретения — удешевление, увеличение выхода биомассы и уменьшение сроков выращивания продуцентов.

Готовят питательную среду на основе экстракта водородокисляющих бактерий Alcaligenes eutrophus ВКМ

В-1323.

2 (54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ НЕСПОРОВЫХ БАКТЕРИЙ (57) Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано в микробиологической промышленности для культивирования неспоровых бактерий. Цель изобретения удешевление среды, увеличение выхода биомассы и сокращение сроков культивирования. Изобретение заключается в том, что в качестве углерод-и азотсодержащей основы питательной среды для неспоровьж бактерий, содержащей пептон (0,9-1, 1 мас.!o) и хлористый натрий (0,5-0,7 мас.X), используют кислотный экстракт водородокйсляющих бактерий Alcaligenes eu1:rophus

BKN В-1323 в количестве, обеспечивающем содержание аминного азота от

60 до 240 мг/л, 3 ил. 2 табл.

Для приготовления экстракта 50150 r биомассы водородокисляющих бактерий суспензируют в 1 л дистиллированной воды, подкисленной соляной кислотой до значения рН 3,03,5. Суспензию выдерживают на кипящей водяной бане в течение 1,0-1,5 ч °

После охлаждения остатки клеток бактерий отделяют от экстракта центрифугированием. Экстракт нейтрализуют раствором гидрата окиси натрия.

Экстракт, полученный таким образом, имеет следующий состав, г/л:

Азот общий 2,1

Азот аминный 0,350

1490155

2,3

Углероды общие

Нуклеиновые компоненты 2,1

Аминокислоты:

Лизин 0,661

Гистидин 0,116

Аргинин 0,256

Аспарагиновая кислота 10

Треонин

Серия

Глутаминовая кислота 0,620

Пр олин 0,193

Глицин 0,285

Алании 0,458

Цистин 0,545, Валин 0,325

МЕтионин 0,089 20

Изолейцин О, 172

Лейцин 0,292

Тирозин 0,123

Фенилаланин . 0,176

Питательную среду для выращивания 25 микроорганизмов на основе экстракта водородокисляющих бактерий готовят из расчета содержания аминного азота в среде 60-240 мг/л, добавляя в среду необходимые компоненты: пеп- 30 тон в количестве 0,9-1,1Х и хлористый натрий 0,5-0,7Х.

0,673

0,263

0,178

Пример 1. К экстракту водородокисляющих бактерий с содержанием аминного азота, равным его содержа- 35 нию в мясной воде (120 мг/л), добавляют 1Х пептона и 0,5Х NaC1. В колбы объемом 500 мл вносят 200 мп приготовленной среды и автоклавируют при

1 атм в течение 30 мин. Затем.в сре- 40 ду вводят 1 мл инокулята суточной суспензии Escherichia coli N .(H 11, Ежесуточно измеряют прирост биомассы на мембранных фильтрах. Для этого используют предварительно высушенные 45 до постоянного веса мембранные фильтры У 8 "Синпор". Через фильтр пропускают 10 мл культуры Е.coli затем его высушивают до постоянного веса.

Разница в весе фильтра до и после фильтрации культуры составляет суточный прирост биомассы бактерий Е.coli.

Как видно из результатов, представленных на фиг.1, среда, содержащая азот в количествах, близких к содержанию его в контроле, благоприятна для развития Е.coli. В первые трое суток роста прирост биомассы Е.coli на опытной и контрольной средах почти одинаков, на четвертые сутки отмечено увеличение скорости роста

Е.coli на опытной среде, в результате чего прирост биомассы более чем в 2 раза (кривая 5) превысил прирост в контроле (кривая 3).

Пример 2. К экстракту водородокисляющих бактерий с концентрацией аминного азота 60 мг/л добавляют 1Х пептона и 0,5Х NaC1. В колбы объемом 500 мл вносят 200 мл приготовленной среды и автоклавируют в течение 30 мин. Затем в среду вводят

1 мл инокулята суточной суспензии

Е.coli И20-111. Ежесуточно измеряют прирост биомассы на мембранных фильтрах. Как видно из результатов, представленных на фиг.1, данная среда благоприятна для развития E.coli.

Уже на третьи сутки наблюдается наи-, больший прирост биомассы, превышающий прирост в контроле почти в 3 раза (кривая 4).

Пример 3. К экстракту водородокисляющих бактерий с содержанием аминного азота 40 мг/л добавляют

1Х пептона и 0,5Х NaC1. В колбыобъемом 500 мл вносят 200 мл приготовленной среды и автоклавируют в течение 30 мин. Затем в среду вводят 1мл инокупята суточной суспенэии Е.coli

N".0-111. Ежесуточно измеряют прирост биомассы на мембранных фильтрах. Как видно из результатов, представленных на фиг.1, на данных средах прирост биомассы ниже контрольного в 2-5 раз (кривые 1 и 2), что связано с лимитированием роста культуры Е.coli азотом.

Пример 4. К экстракту водородокисляющих бактерий с содержанием аминного азота 240 мг/л добавляют

1Х пептона и 0,5Х МаС1. В колбы объемом 500 мл вносят 200 мл приготовленной среды и автоклавируют в течение 30 мин. Затем в среду вводят

1 мл инокулята суточной суспенэии

Е.coli N.0-111. Ежесуточно измеряют прирост биомассы на мембранных фильтрах. Как видно из резульТатов, представленных на фиг.1, прирост биомассы на данной среде уже на третьи сутки превосходит прирост в контроле соответственно в 2-2,5 раза (кривые

6 и 7).

Пример 5. К экстракту водородокисляющих бактерий с содержанием

1490155 общего азота в 3 и аминного азота в

6 раз больше, чем в контроле, добавляют 1Х пептона и 0,5Х NaC1. В колбы объемом 500 мл вносят 200 мл приго5 товленной среды и автоклавируют в течение 30 мин. Затем в среду вводят

1 мл инокулята суточной суспенэии

Е.coli И70-111. Ежесуточно измеряют прирост биомассы на мембранных фильт- !0 рах. Как видно иэ результатов, представленных на фиг.1, уже на вторые и третьи сутки прирост биомассы значительно превосходит контроль (кривая 8). На четвертые сутки прирост биомассы бып в 5 раэ больше, чем в контроле, и в 2 раза больше, чем на среде, приготовленной из экстракта водородокисляющих бактерий с содержанием общего азота равным контролю.

Пример 6. К экстракту водородокисляющих бактерий добавляют

1Х пептона и 0,5Х NaC1. В колбы объемом 50Р мл вносят 200 мл приготовленной среды и автоклавируют при 25

1 атм в течение 30 мин. Затем в среду вводят 1 мл инокулята суточной суспензии Pseudomonas a8ruginsa

6080. Ежесуточно измеряют прирост биомассы на мембранных фильтрах ° Как 30 видно из результатов, представленных на фиг.2, наибольший по сравнению с контролем (кривая 3) прирост биомассы Ps.a eruginosa 6080 наблюдается на средах, приготовленных на основе экстракта водородокисляющих бактерий с содержанием аминного азота 120 мг/л кривая 5) или в 2 раза меньшим (кривая 4). На средах, приготовленных на основе экстракта водородокисляющих бактерий с содержанием аминного азота 30-40 мг/л, прирост биомассы уже на третьи сутки резко па" дает (кривые 2 и 1), уменьшаясь по сравнению с контролем соответственно в 3 и 14 раэ.

Пример 7. К экстракту водородокисляющих бактерий добавляют

1Х пептона и 0,5Х NaC1. В колбы объемом 500 мл вносят 200 мл приготовленной среды и автоклавируют при 1 атм в течение 30 мин. Затем в среду вводят 1 мл инокулята суточной суспенэии Staphylococcus aureus 453. Ежесуточно измеряют прирост биомассы на мембранных фильтрах. Как видно

55 иэ результатов, представленных на фиг.3, на среде, приготовленной на основе экстракта водородокисляющих бактерий с концентрацией аминного азота 120 мг/л, уже на третьи сутки прирост биомассы St.aureus (кривая 3) равен приросту в контро:;е (кривая 2).

На среде с экстрактом водородокисляющих бактерий, имеющим концентрацию аминного азота 60 мг/л, отмечается резкое увеличение скорости роста St.aureus (кривая 5). На третьи сутки роста прирост биомассы на данной среде выше контрольного в 3 раза. На средах, приготовленных на основе экстракта водородокисляющих бактерий с содержанием аминного азота 30-40 мг/л, прирост биомассы

St.aureus сначала возрастает, затем начинает падать до уровня контроля (крявая 3) или становится меньше контроля в 1,5 раза (кривая 1).

Пример 8. Экстракт водородокисляющих бактерий испольэовали как составную часть элективной для ста-, филококка питательной среды — желточно-солевого агара. Готовят контрольную питательную среду на основе мясной воды иэ говяжьего мяса. Контрольная среда содержит на 1л мясной воды

10 r пептона, 65 г хлористого натрия, 35 r агар-агара, рН 7,2-7,4. В стерильную среду, охлажденную що 56 С, вносят асептически 330 мл эмульсии яичного желтка и разливают по чашкам

Петри. Аналогично готовят опытную среду с заменой мясной воды экстрактом водородокисляющих бактерий Alcaligenes eutrophus BKN В-1323 с различным содержанием аминного азота.

Сравнение опытной и контрольной питательных сред проводят в трех направлениях: определение скорости роста; определение всхожести бактериальной культуры; подтверждение постоянства свойств культуры, определяющих ее патогенность.

Для определения всхожести используют метод серийных разведений с высевом на опытные и контрольную среды определенной дозы культуры (от

1 млрд до f0 клеток в 1 мл суспензии). Посевы инкубируют в течение

24 ч при 37 С, а затем 24 ч при комнатной температуре. Учет результатов проводят через 17; 24; 36 и 48 ч.

Всхожесть культуры St aureus 453 в зависимости от концентрации аминного азота экстракта Alcaligenes eutro

1490155

phus ВКН В-1323 водородокисляющих бактерий и посевной дозы представлены в табл,1.

Из табл. 1 видно, что всхожесть

St.aureus 453 во всех опытных образцах близка или незначительно превышает таковую на контрольной среде.

При содержании аминного азота в опытной среде 17 мг 7. (170 мг/л) наблюдаются наилучшие результаты по всхожести. Согласно требований нормативно-технической документации число выросших колоний подсчитывают через 48 ч инкубации. Во всех опытных вариантах число колоний через 48 ч не изменилось по сравнению с числом колоний, учтенных через 17 ч,, что свидетельствует о высокой скорости роста на испытуемых средах. Применение новых сред позволяет сократить время анализа на 1 сут.

Одним из важных физиологических и диагностических признаков патогенного стафилококка является образование лецитовителлаэного венчика вокруг колоний. Этот признак на опытных средах четко проявляется уже через

17 ч (при 10 пассажах), в то время как в контроле он проявляется через

24-48 ч. Колонии на опытных средах превосходят по величине колонии в контроле в 1,5-2 раза (3 мм в диаметре в опыте против 1-2 мм в контроле).

Таким образом, замена мясной воды экстрактом водородокисляющих бактерий для St aUreus сказалась благоприятно на всхожести, скорости роста и устойчивости физиологических свойств (в частности, образования

40 лецитовителлаэного венчика) .

Пример 9. Основным дифференциально-диагностическим тестом дифтерийной палочки Corynebacteria 45

diphtherial gravis 665 является наличие фермента цистиназы. По скорости синтеза этого фермента судят об активности. культуры. Эти свойства определяются скоростью ферментатив50 ного расщепления цистина и образованием из него сероводорода, взаимодействующего с усксуснокислым свинцом с образованием сернистого свинца (соединения темнокоричневого цвета). Для этой цели используют среду следующего состава: 0,5 л мартеновского пептона; 0,5 л мясной воды;

15 г агар-агара; 22 мл 1Х-ного растФормула изобретения

Питательная среда для выращивания неспоровых бактерий, содержащая источник углерода и аминного азота, пептон и хлористый натрий, о т л и— ч а ю щ а я с я тем, что, с целью удешевления, увеличения выхода биомассы и сокращения сроков культивирования продуцентов, среда содержит в качестве источника углерода и аминного азота кислотный экстракт водородокисляющих бактерий AlcaliЪ

genes eutrophus ВКМ В-1323 в количестве, обеспечивающем содержание аминного азота от 60 до 240 мг/л, при следующем соотношении компонентов среды, г/л:

Пелтон

9,0-11,0 вора цистина; 10 мл 10Х.-ного раствора уксуснокислого свинца и 90 мл лошадиной или бычьей сыворотки.

Среду разливают столбиком высотой

2-3 см. Посев культуры производят уколом. Результаты учитывают через

20-24 ч с момента посева. При посеве уколом коринебактерии дифтерии образуют интенсивное потемнение по ходу укола и вокруг него характерное

"облачко" темно-коричневого цвета на расстоянии 1 см от поверхности агара. Опытную среду готовят аналогично примерам 1-7, но с различной концентрацией аминного азота (табл.2).

В табл.2 дана скорость образования и диаметр "облачка" в зависимости от концентрации аминного азота.

Иэ результатов, представленных в табл. М 2 видно, что скорость образования "облачка", а следовательно, и скорость выявления дифтерийной палочки в опыте значительно превосходит контроль. Интенсивность окрашивания и диаметр "облачка" в опытных средах также превосходит эти показатели в контроле. Исключение составляет опытная среда, содержащая экстракт водородокисляющих бактерий с низкой концентрацией аминного азота (3 мг 7). Причиной этому является, вероятно, лимит по азоту. Таким образом, испытанные среды пригодны для выявления С.diphtherial gravis u позволяют в более ранние сроки дифференцировать патогенные виды этого рода бактерий от непатогенных.

1490155 бактерий с содержанием аминного азота от 60 до

240 мг/л

Хлористый натрий

Экстракт водо5,0-7,0

Дс : л. родокисляющих

Таблица 1

Среда

Посевная доза

Содержание аминного

Количество клеток в 1 мл суспензии

1000 100 1О азота, мг 7.

10000

Количество выросших колоний

50

500

8600

33

17

700

9200

Таблица 2

Интенсивность реакции

Время появления

"облачка", ч

Содержание аминного

Среда азота, мг, 7.

Контрольная

Опытная

+++

+++

П р и м е ч а н и е. ++++ — диаметр облачка 10 мм и более, темно-коричневого цвета;

+++ — диаметр облачка 7-10 мм, коричневого цвета;

+ — диаметр облачка 3-7 мм, светло-коричневого цвета;

+ - отсутствие облачка, почернение среды по уколу.

Контрольная

Опытная

2

38

12

61

16

16

18

18

18

++++

++++

++++

++++

++++

1490155

° фф

В

g gd ф фФи. 1 т и д сулвни

0 бремя сутки

Риг. 3

Составитель Е.Воробьева

Техред Л.Олийнык Корректор Т.Малец

Редактор M.ÏåòðîBà

Подписное

Заказ 3651/29

Тираж 500

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород,,ул. Гагарина, 101 015

3 ц а

lP

1ю

1,Ф ф Ю р