Способ получения рекомбинантной плазмидной днк, кодирующей синтез бычьего или человеческого гормона роста
Патент 1491346
Авторы
Классы МПК
Способ получения рекомбинантной плазмидной днк, кодирующей синтез бычьего или человеческого гормона роста
Иллюстрации
Реферат
Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии и касается способа конструирования рекомбинантных плазмидных ДНК, кодирующих синтез бычьего или человеческого гормона роста. Цель изобретения - повышение выхода метиолинового гормона. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК путем объединения BAM H 1 - XBA 1 или BAM H 1 - ECOR 1 фрагмента плазмиды PC4101 с XBA 1 - BAMH 1 фрагментом плазмиды PNM 789в с BAM H1-FNU2 фрагментом плазмиды PNM575. Дополнительно к полученной рекомбинантной плазмидной ДНК можно присоединить ECOR1-CLA1 фрагмент плазмиды PNM 608. 2 табл.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК д 4 С 12 N 15/00
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К flATEHTV
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
1 (21) 3862498/28-13 (22) 04 ° 03.85 (31) 586592 (32) 06.03.84 (33) US (46) 30.06.89. Бюл. У 24 (71) Эли Лилли энд Компани (US) (72) Рональд Джордж Шонер и Бригитте Элизабет Шонер (US) (53) 575.224.2.577.2(088.8) (56) Патент GB У 2121054, кл. С 12 N 15/00, 14.12.83. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ
ПЛАЗМИДНОЙ ДНК, КОДИРУЮЩЕЙ СИНТЕЗ
БЪ|ЧЬЕГО ИЛИ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ГОРМОНА
РОСТА
Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии и касается способа конструирования рекомбинантных плазмидных ДНК, кодирующих синтез бычьего или человеческого гормона роста.
Целью изобретения является повышение выхода метионинового гормона роста.
Конструирование плазмиды осуществляют путем объединения BamHI-XbaI или BamHI-EcoRI фрагмента плаэмиды
pCZI0l c XbaI-BamHI фрагментом плазмиды pNM789b с BamHI-FnuII фрагментом плазмиды рЪ1М575. Дополнительно к полученной рекомбинантной плазмидной ДНК присоединяют EcoRI-ClaI фрагмент плазмиды pNM608 с синтетическим линкером...SU„„1491346 A 3
2 .(57) Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии и касается способа конструирования рекомбинантных плазмидных ДНК, кодиp mHõ синтез бычьего или человеческого гормона роста. Цель изобретения — повышение выхода метионинового гормона. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК путем объединения BamHI-Xb;, Т или BamHI-EcoRI ! фрагмента плазмиды рС4101 с XbaIВаш1П фрагментом плазм: ды рЫМ789в с BamHI-FnuIT фрагментом ллазмиды
pNM575. Дополнительно к полученной рекомбинантной плазмидной ДНК можно присоединить EcoRI-ClaI фрагмент плазмиды рЪ1М608, 2 табл., Способ иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. В качестве исходного материала используют " 5,1кЬ фрагмент, полученный Xbal-ВатпНТ рас— щеплением плазмиды РКЕ11021.
Плазмиду pKEN021 получают из
pKENIII :ледующим образом: Около
50 мкг pKKNIII выжигают 25 ед. HpaII рестрикционного фермента в 300 мкл буфера, содержащего 20 мМ НС1 (pH 7,4), 10 мМ MgCle и 6 мМ Ь-меркаптоэтанола, при 37 С в течение
2 ч, Полученную смесь дважды экстрагируют 300 мкл смеси (50:50) фенола и хлороформа. Выделенную водную фазу осаждают затем 2,5 объемами этанола и 0,1 объемами 3М ацетата натрия, ДНК растворяют в 100 мкл электрофо1491346 резного буфера и фракционируют на
5Х-ном полиакриламидном геле (акриламид:бис отношение составляет 29:1 во всех гелях, кроме тех, на которые есть специальное указание). Гель окрашивают в растворе, содержащем
0,5 мкг/мл этидиумбромида, и проявляют полосы длинноволновьм ультрафиолетовым излучением. Полосу 950Ьр выделяют и извлекают из еля электроэлюированием в камере диализа. Затем проводят экстракцию смесью фенол/СНС1 и осаждение этанолом.
Выделенные ДНК (приблизительно
2,5 мкг) растворяют в 25 мкл TEN (10 мМ NaC1, 10 мИ Tris HC1, рН 7,4, и 1 мМ натрийэтилендинитрилтетраацвтата ЕДТА), рН 8,0).
Около 2 мкг 950Ьр Hpall фрагмента выжигают A1UI рестрикционным ферментом в 200 мкл буфера, содержащего
50 ьИ NaC1, 6 мМ Tris, НС1 (рН 7,6), 6 мМ MgClq и 6 мМ Р -меркаптоэтанола, в течение 2 ч при 37 С. ДНК фрак! ионируют на 6Х-ном полиакриламидном геле. Полученный 462Ър AluI фрагмент выделяют и очищают описанным ранее способом. Фрагмент 4 2Ьр AluI (приблизительно 1 мкг) растворяют в
10 мкл Т4 ДНК лигазного буфера (66 мМ Tris НС1, рН 7,6; 10 мМ MgCQ, 1О мМ дитиотретиол, 0,4 мМ АТР), содержащего 150 пмоль фосфорилированного Есок? линкера (5 GGAATTCC3 ) и 2 ед. Т4 ДНК лигазы. После инкубирования при 4 С в течение !6 ч полученную смесь нагревают при 65 С в течение 10 мин и разбавляют до
1000 мкл, добавляя EcoRI буфер (100 мМ Tris НС1, рН 7,2; 50 мМ
NaC1, 10 мМ МяС1, 6 мИ р-меркаптоэтанола) и 40 единиц EcoRI фермента. Спустя 2 ч при 37 С образец экстрагируют смесью фенол/СНС1> и осаждают этанолом. ДНК растворяют в
20 мкл Т4 ДНК лигазного буфера, содержащего О, 1 ед. Т4 ДНК лигазы и
0,1 мкг pBR322/102, которая была сначала линеаризирована EcoRI, а затем обработана щелочной фосфата0 зой. После лигирования при 4 С в течение 16 м полученную ДНК используют для обычной трансформации
Е.coli штамм К12 НВ101.
Трансформанты выбирают на агарных пластинах, содержащих 12 мкг/мл тетрациклина, плазмиды изолируют из устойчивых колоний методом быстрой щелочной экстракции. Плазмиду, содержащую 466Ър XbaI-BamHI фрагмент, выбирают и используют в качестве исходного материала на описанной далее стадии.
Около 2 мкг этой плазмиды выжигают 2 ед. HindIII фермента в 50 мкл
HindIII буфера (50 мМ NaC1, 10 мМ
1p Tris НС1, рН 7,4; 10 мМ MgC1 и
6 мМ Р-меркаптоэтанола) в течение часа при 37 С. После экстрагирования о смесью фенол/СНС1 и осаждения этанолом ДНК растворяют в 200 мкл буфера, !
5 содержащего 300 мМ NaC1, 30 мМ натрийацетата (рН 4,25), 1 мМ 2пС1д и
200 ед. 81нуклеазы. Спустя час при
15 С реакцию останавливают экстракцией смесью фенол/СНС1 и осаждением этанолом. Полученну10 ДНК растворяют в 10 мкл Т4 ДНК лигазного буфера, содержащего 20 пмоль фосфорилированных
BamHI линкеров (5 CCGGATCCGG3 ) и
2 ед. Т4 ДНК лигазы. Спустя 16 ч
25 при 4 С реакционную смесь нагревают при 65 С в течение 10 мин для инактивации лигазы, а затем разбавляют до 100 мкл в BamHI буфере (150 мИ
NaC1, 20 мМ Tris НС1, рН 8,0; 10 мМ
30 MgClq, 6 мМ (Ь-меркаптоэтанола), содержащем 20 ед. BamHT фермента. Спустя 2 ч при 37 С полученную смесь очищают на !Х-ном агарозном геле. Гель окрашивают, больший фрагмент (4,5 МЬ) выделяют элюированием после вымораживания, а затем очищают, экстрагируя смесью фенол/СНС1 и осаждая этанолом. Выделенный фрагмент с BamHI липкими концами растворяют в 20 мкл
40 Т4 ДНК лигаэного буфера, содержащего
0,1 ед. Т4 ДНК лигазы. Спустя 16 ч при 4 С ДНК используют для трансфор мацни Е.coli HB1 Ol. Трансформанты отбирают по устойчивости к ампициплину.при 100 мкг/мл и скринируют по чувствительности к 10 мкг/мл тетрациклина. Некоторые плазмиды, являющиеся Ар Тс, исследуют на отсутстГ вие HindIII сайта и присутствие одиночного BamHI сайта. EcoRI, SaII
50 последовательная обработка дает фраг— мент 466 и 305Ър.Плазмиду с такими характеристиками отбирают, а затем модифицируют для превращения EcoRI сайта, расположенного раньше lрр
55 промотора, в Н пй111 рестрикционный сайт.
2 мкг плазмиды гидролизуют в
100 мкл EcoRI буфера с 0,2 ед. EcoRI
5 !4 в течение 10 мии при 37 (:, Реак цию останавливан т, нагревая в течение
10 мин при 65 (:, а посл экстрагирпвания смесью Аеиол/СНС1 ДНК осаждают этанолом, растворяют в 200 мкл
SI нуклеазного буфера, содержащего
SI нуклеазу при 1000 ед/мл, и ведут реакцию при 12 С в течение часа. о
Реакцию останавливают экстрагироваиием смесью фенол/СНС1ь и осаждением этанолом. Полученную ДНК вновь суспендируют в 10 мкл Т4 ДНК лигазного буфера, содержащего 20 пмоль фосфорилированного HindIII линкера (5 CCAAGCTTGG 3 ) и 2 ед, Т4 ДНК лигазы. Спустя 16 ч при 4"G смесь на-, гревают в течение 10 мин при 65 С, разбавляют до 150 мкл HindIII буфером, содержащим 10 ед. HindIII фермента, инкубируют в течение 2 ч при
37 С, а затем фракционируют на 17-ном агарозном геле. Самую большую полосу (эквивалентную единичному отрезку плазмиды) обычным способом выделяют и очищают, растворяют в 20 мкл Т4 лигазного буфера, содержащего 0,2 ед.
Т4 лигазы, инкубируют 16 ч при 4 С, а затем используют для трансформации
Е.coli НВ101. Трансформанты отбирают по устойчивости к ампицил .ину, выделенные плазмиды анализируют обычным способом рестрикционным ферментным анализом. Отбирают плазмиду с
EcoRI-HindIII фрагментом 500Ьр и используют в качестве клонирующего вектора для добавления 3 участка lрр гена.
Около 2 мкл плазмиды выжигают в
50 мкл SaII рестрикционного буфера (150 мМ NaC1, 6 мМ Tris НС1, рН 7,9;
6 мМ MgC1, 6 мМ !5-меркаптоэтанола) с 2 ед. SaII в течение часа при
37 С, а затем разбавляют до 150 мкл в BamHI буфере, содержащем 2 ед.
BamHI. Спустя час при 37 С добавляют
2,5 ед. щелочной фосфатазы, а затем продолжают инкубирование в течение часа при 65 С. Материал экстрагируют смесью фенол/CHC1, осаждают этанолом, растворяют в TEN и используют в качестве клонирующего вектора для фрагмента 1рр 3 .
Для получения фрагмента, содержащего 1рр 3 участок, 10 мкг pKENIII выкигают в 100 мкл Нра? буфера (20 мМ КС1; 10 мМ Tris НС1, рН 7,4;
10 мМ MgC1 и 6 мМ Р-меркаптоэтанола) с 10 ед. HpaI в течение 2 ч при
9! 346 6 7 "(, е ПГ)сл(3KcT ps Гnpon:31!nR c 1(Гьí феиол/СНС1 и осаждения этаиолом
1О
m!! растворяют в 0 мкл Т4 ПН! лигазиогo буфера, содержащего 20 пмоль фосфорилироваииого SaI I линкор» (5 СGTCGACC 3 ) и 2 ед, Т4 ДНК лигазы, а затем иикубируют в течение
16 ч при 4"Г. !игаэу ииактивируют, нагревая при 65 С в течение 10 мин.
Полученный материал разбавляют до
100 мкл в Ба?1 буфере, содержащем !
0 SаТТ, инкубируют в течение часа при 37 С, а затем разбавляют до 300 мкл в PVUII буфере (60 мМ
NaCl Ь мМ Tris. НС1, рН 7,5; 6 мИ
MgC1 ) 6 мИ P — меркanтоэтанола), содержащем 10 en. PVUII рестрикционного фермента. Спустя час при 37 С
ДНК фракиионируют на 57-ном полиакриламидном геле. Приблизительно
0,5 мкг 950bp фрагмента выделяют, очищают и растворяют в ТЕМ, 0,02 мкг фрагмента разбавляют в 20 мкл Т4 ДНК лигазного буфера, содержащего 20 пмоль фосфорилированиого BamHI линкера (5 CCGGATCCGG3 ) и 2 ед. Т4 ДНК лигазы, а затем инкубируют в течение
16 ч при 4 С. Полученную ДНК нагре- вают в течение 10 мин при 65 С, разбавляют до 100 мкм BamHI буфером, содержашим 20 ед. BamHI, инкубируют в течение 2 ч при 37 С, а затем фракционируют íà 5Х-ном полиакриламидном геле до удаления избытка линкерных молекул. Полученный 950bp фрагмент, содержащий BamHI u SaII липкие концы, обычным способом очищают и растворяют в 20 мкг Т4 ДНК лигазного буфера, содержащего 0,2 мкг клонирующего вектора, описанного ранее, и 0,2 ед.
Т4 ДНК лигазы. После инкубирования в течение 16 ч при 4 С ДНК используо ют для трансформирования Е.coli K12
НВ101. Плазмиды получают из устойчивых к ампициллину трансформаторов и обычным способом анализируют на наличие SalI-BamHI фрагмента. Целевую плазмиду ("5,2kb) обозначают рКЕИ021.
10 мкг pKEN021 выжигают при 37 С в 200 мкл XbaI/BamHI буфера (150 мМ
NaCl, 10 мМ Tris НС1, рН 8; 10 мМ
MgC1g 6 мМ Р-меркаптоэтанола), используя 10 ед. ВашНТ в течение часа, а затем 10 ед, XbaI еще в течение часа при 37 С. Целевую XbaI-BamHI выкженную ДНК обрабатывают затем
2,5 ед. щелочной фосфатазы в течение 1,5 ч при 65 С, экстрагируют
1491346 хЬв1
5 СТАРАСИТАТТААТААТРТТСССАТТССАТ&АТФАТОАТАЛСТТСССААт т т t t т т т t т т I t t t t l ò т е е т т f t t t I t е е t ò å I I т t e I t е т е е е
3 ТСССАТААТТАТТАСААФЮСТААССТАСТАСТАСТАТТСААМИТCCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTCACAACGCTATOCTCCO 3 т Emanent
t I1l l t 1 Ill f f1f f f f f f f f f f f f f tте f tl11f f t t1
GGTAAGGGAATLGGTCCGAAAAAGTGTTGCGATAGGAGGG т смесью фенол/СНС1э, осаждают этанолом и растворяют в 50 мкл TEN для дальнейшего использования °
Плазмиду ptrpED50chGH800 исполь5 зуют в качестве источника ДНК фермента, содержащего кодирующую последовательность для части гена гормона роста человека. Генная часть плаэмиды ptrpED50chGH800 человеческого гормона роста содержит уникальный ,SmaI рестрикционный сайт на 6Ър после трансляционного терминационного кодона гена. Этот сайт заменяют на
BamHI сайт, используя нижеследующую методику: 6 мкг плазмиды выжигают
6 ед. Вша? в 200 мкл SmaI рестрикционного буфера (15 мМ Tris.ÍÑ1, рН 8,0; 6 мМ МяС1,.15 мМ КС1 и 6 мМ -меркаптоэтанола) в течение 1,5 ч 2р при 37 С. После завершения выжигания осуществляют экстракцию смесью фенол/СНС1з, вьщеляют ДНК, осаждая этанолом, а затем растворяют в 24 мкл
TEN. 40 пмоль фосфорилированного 25
BamHI адаптерного фрагмента добавляют к 0,5 мкг (0,2 пмоль, концы) выжженной описанным выше способом плазмиды в 16 мкл лит аэного буфера, содержащего 2 ед. Т4 ДНК лигазы. Полученную смесь инкубируют в течение
2 ч при 22 С, 16 ч — при 4 С, а затем IO мин при 65ОС. BamHI липкий конец получают обычным выжиганием BamHI рестрикционным ферментом, фермент расщепляет линкерную последователь35 ность так же, тсак BamHI сайт, расположенный в начале клонированной кДНК последовательности человеческого гормона роста. Это дает 691Ьр фраг- 40 мент с липкими BamHI концами, который вьщеляют сначала на 6Х-ном полиакриламидном геле, а затем — обычным способом. Выделенный ДНК фрагмент лигируют (используя 0,2 ед. Т4 45
ДНК лигаэы в 20 мкл буфера в описанных ранее условиях) с 0,2 мкг BamHf, выжженной и обработанной щелочной фосфатазой pBR322. Спустя 16 ч при
4 C полученный материал используют для трансформирования Е.coli штамм
JA221/NRR7D-15014). Трансформанты отбирают на агарных пластинах, содержащих 100 мкг/мл ампициллина, затем обычным способом вьщеляют плазмиды, и дентифицируют рестрикционным ферментом и анализируют с помощью гель-электрофореза. Целевые плазмиды, обозначенные,рММ575, содержат BamHI фрагмент (приблизительно 700Ьр), их размножают обычным способом для дальнейшего использования.
ДНК последовательность зрелого человеческого гормона роста содержит один FnuDII сайт, который составляет 47bp из первого нуклеотида.
25 мкг pNM575 выжигают в 250 мкл
BamHI буфера с 25 ед. BamHI npu
37ОС в течение часа. 691Ър фрагмент с BamHI липким концом обычным способом изолируют из 6Х-ного полиакриламидного геля и очищают. После очистки фрагмента одну треть его (эквивалент 8 мкл плазмиды) выжигают в 100 мкл FnuDII буфера (6 мМ
NaC1, 6 мМ Tris НС1, рН 7,4; 6 мМ
MgCla., 6 мМ Р-меркаптоэтанола) с
2,5 ед. FnuDII в течение 1,5 ч при
37 С. Электрофорез íà 6Х-ном полиакриламидном геле и стандартная методика выделения дают воэможность вьщелить 538bp ДНК фрагмент, содержащий кодирующую последовательность для последних 175 аминокислот гена с последующем трансляционным стопсигнапом.
Двухнитевой ДНК фрагмент синтезируют фосфотриэфирным способом для присоединения lрр промоторного участка с кодирующим участком гормона роста человека.
1491346
Получают следующие сегыечты:
j) CTAGAGGGTAT
2) TAATAATGTTCC
3) CATTGGATGAT
4) GATGATAAGTTCС
5) CAACCATTCCC
6) TTATCCAGGC
7) TTTTTGACAACG
6) Стдтсстссс
g) CATTATTAATACCC Т
10) ATGGGAA
11) СТТАТ САТ САТ С СА
12) (:сттсссАА
15) GGATAAGGGAAT
20
f4) GTCAAAAAGCCT
f5) СGGAGcATAGCGTт
Используя полученные описанным выше способом сегменты, реакцию присоединения, каталиэируемую Т4 лигазой, осуществляют поэтапно: а) 5 -нефосфорилированный сегмент 1 присоединяют к 5 -фосфорилиро-! ванному сегменту 2 в присутствии
5-фосфорилированного сегмента 9, используя Т4 лигазу для получения ДНК дуплекса 1. Дуплекс выделяют препаративным гель-электрофорезом на
15Х-ном полиакриламиде;
b) 5 -фосфорилированный сегмент
3 присоединяют к 5 -фосфорилирован- 40 ному сегменту 4 в присутствии 5 — фосфорилированного сегмента 11, используя Т4 лигазу для получения ДНК дуплекса 2, который очищают на 15Хном полиакриламидном геле с помощью 45 электрофореза; с) 5 -фосфорипированный сегмент 5 присоединяют к 5 -фосфорилированному сегменту 6 в присутствии 5 -фосфорилинованных сегментов 12 и 13, используя Т4 лигазу для получения
ДНК дуплекса 3, который очищают с помощью электрофореза íà 15Х-ном полиакрилакидном геле;
d) 5 -фосфорилированный сегмент 7 присоединяют к 5 -фосфорилированному сегменту 8 в присутствии 5 -фосфорилированного сегмента 14 и 5 -нефосфорилированного сегмента 15, используя Т4 лигаэу для обраэованив
JIHK л .плекса 4, которьпi очак ают электрофореэо.1 иа 152-ном полиакриламидном геле; е) ДПК дуплексы 2,3 и 4 сосдиняют затем вместе Т4 лигазой до образовàHèÿ ДНК дуплекса 5, KоторbIA очищают с помощью электрофореза на
15Х вЂ” ном полиакриламидном геле;
f) 5 -фосфорилированный сегмент
10 и ДНК дуплекс 5 добавляют в присутствии Т4 лигаэы к ДНК дуплексу 1. Полученный ДНК дуплекс очищают с помощью электрофореэа на
15Х-ном полиакриламидном геле. Затем ДНК дуплекс ферментативно фосфорилируют, используя Т4 полинуклеотидкиназу и (к ) АТР в соответствии с установленной методикой.
Экспрессионную плазмиду PNM702 конструируют ферментативным присоединением 0,1 пмоль (0,4 мкг) XbalBArnHI фрагмента плазмиды pKEN021, 0,025 пмоль синтетического ДНК фрагмента и 0,3 пмоль (0,08 мкг) 538Ьр фрагмента в 24 мкл лигирующего буфера, используя 1,5 ед. Т4 ДНК лигазы, После инкубирования в течение
16 ч при 4 С полученную смесь используют для трансформирования Е.со1 .
JA221, как было описано ранее.
Трансформанты отбирают на агарных пластинах, содержащих 100 мкг/мл ампициллина, и обычным способом культивируют в качестве предпочтительного источника целевой плазмиды экспрессии.
Экспрессию человеческого гормона роста определяют по стандартной методике радиоиммуноанализа. При определении она составляет по крайней мере, 2 мпн. молекул на клетку.
Плазмиду pNM702 экспрессии человеческого гормона роста используют в качестве исходного материала при конструировании плазмиды, экспрессирующей Met-Phe Pro-Keu-Авр-Asp-Asp-Asp-Jvs-ЬСН.
Плазмиду pBR348 используют в качестве источника двух фрагментов
ДНК, содержащих кодирунщую последовательность для части гена бычьего гормона роста. Плаэмида содержит
831bp бычий гормон роста — кодирующую последовательность, клонированную. в PstI рестрикционный сайт
pBR322.
10 мкг pNM702 частично выжигают
1 ед. PVUII в 00 мкл PVUII рестрик1491346
12 хна ю
5 CTAGAGGGTATTAATAATGTTCCCATTGGATGATGATGATAAGf l l t I I 1 f f f f t f t I I t t f f I I f f f t f f 1 f f l f f f l f I l
3 TCCCATAATTATTACAAGGGTAACCTACTACTACTATTC>I ДЯОИ
ТТCCCAGCCATGTCCTT GTC
1II 11II I I I 1 Ill l l l t I
1 AGGGTCGGTACAGGAACAGGC
1) C TAG ÑGGTÄT
2) TAATAATGTTCC
3) CATTCGATGAT
4) СйтаятМсттСС
5) CAGCCATGTCCTTGTC ционного буфера (60 иМ NaCl 6 мМ
Tris НС1, рН 7,5; 6 мМ MgClq, 6 мМ
Р-меркаптоэтанола) в течение 10 мин при 37 С. После прекращения реакции нагреванием в течение 10 мин при
65 С ДНК материал обрабатывают щелочной фосфатазой и выделяют фрагменты на 1Х-ном агароэном геле. Линейный ДНК фрагмент размера, соответствующего ДНК без 497Ьр PVUII фрагмента (выходит несколько раньше, чем плазмида с одним разрывом), обычным способом выделяют, очищают и используют при конструировании промежуточной плазмиды.
Фрагмент 494Ьр PVUII плаэмиды
pBR348 получают выжиганием 10 мкг плазмиды в 200 мкл pVUII буфера,, содержащего 10 ед. pVUII в течение часа при 37 С. Эти фрагменты выделяют на 6Х-ном полиакриламидном геле, целевой 494Ьр обычным способом проявляют и очищают. !
Промежуточную плазмиду конструируют, осуществляя взаимодействие
0,2 мкг плазмиды pNM702 PVUII Арагмента с 0,05 мкг 494Ьр фрагмента в
20 мкл Т4 ДНК лигаэного буфера, содержащего 2 ед. Т4 ДНК лигазы, в течение 16 ч при 4 С. После трансформации и селекции трансформантов на устойчивость к ампициллину плаэмиды обычным способом анализируют на присутствие и соответствующую ориентацию 494Ьр PVUII фрагмента. Плазмиды с 494Ьр PVUII фрагментом и 440Ър
KbaI-Small ôðàãìåíòîì отбирают для
При получении 63Ьр фрагмента приготавливают следуннчие 9 сегментов: использования при дальнейшем конструировании.
10 мкг промежуточной плазмиды выжигают 1 ед. PVUII в 200 мкл PVUII буфера в течение 5 мин при 37 С. После нагревания в течение 10 мин при
65 С полученную смесь распределяют на 17. — ном агарозном геле, выделяют
10 линейную ДНК, имеющую только один единичный PVUII разрыв на молекулу, и очищают. Выделенный материал (приблизительно 3 мкг) полностью выжигают
5 ед. XbaI и обрабатывают щелочной
15 фосфатаэой. Эти фрагменты распределяют на IX-ном агарознои геле, самый большой из них (потерявший 109bp фрагмент между XbaI и первым сайтом
PVUII в человеческои и бычьем гормо20 не роста) выделяют обычным способом.
ДНК последовательность для первых 23 аминокислот (69Ър) бычьего гормона роста до первого PVUII сайта содержит 2HpaII рестрикционных сайта, первый из которых расположен на 23Ър от первой нуклеотиды кодирующей последовательности. 63Ьр фрагмент синтезируют фосфортриэфирным способом. Этот первый фрагмент соот30 ветствует 19Ьр последовательности от
XbaI сайта в 1рр рибосомном связывающем сайте через АТС-трансляционный стартовый сигнал с последующей кодирующей последовательностью для Phe-Pro-Zeu-Asp-Asp-Аяр-АБр-Zys (24Ьр) и 20 нуклеотидаии кодирующей последовательности бычьего гормона роста (от Phe до первого HpaII сайта) и имеет следующую последовательность:
5) ATGGGAACATTATTAATACC CT
7),ГтАтсА ГсАтсAYС СА
8) ать(стасо я дс
g) Са@Д CAAGC Ac
Используя приготовленные ранее сегменты, осуществляют поэтапное присоединение, катализируя процесс Т4 лигаэой:
13! 491346 а) 5 -нефосфорилированный сегмент 1 присоединяют к 5 -фосфорилированному сегменту 2 в присутствии
5 -фосфорилированного сегмента 6
5 используя Т4 лигазу для образования
ДНК дуплекса 1, который очищают электрофорезом на 15Х-ном полиакрипамидном геле;
Ь) 5 -фосфорилированные сегменты
3,4 и 5 соединяют в присутствии 5 — фосфорилированного сегмента 9, используя Т4 лигазу для получения ДНК дуплекса, который очищают с помощью электрофореза на 15Х-ном полиакриламидном геле. Затем ДНК дуплекс ферментативно фосфорилируют, используя
Т4 полинуклеотидную киназу и (g )
ATP с последующей стандартной процедурой. 20
ДНК фрагмент 46Ър, который простирается от описанного HpaII сайта до PVUII сайта, можно сконструировать синтетически или получить из исходной pBR348 плазмиды; 100 мкл 25 плазмиды рВН348 выжигают в 400 мл
PVUII буфера (50 ед. PVUII) в течение 2 ч при 37 C„ После фенольной экстракции и осаждения этанолом ДНК растворяют в 400 мкл PstI буфера 30 (50 мМ На,l бмМ Tris НС1, рН 7,4;
6 мМ MgC1, 6 мМ Р-меркаптоэтанола1 с 50 ед. Pstl s течение 2 ч при 37оС.
ДНК фрагменты распределяют на 6Х-ном полиакрипамидном геле, 135 фрагмент, содержащий целевую 46bp последовательность, вьщеляют и очищают стандартными способами, Одну треть выделенной ДНК (эквивалентно 33 мкг) подвергают ограниченному выжиганию
1 ед. HpaII рестрикционного фермента в 100 мкл HpaII буфера (20 мМ Tris
« НС1, рН 7,4; 7 мМ MgC1 6 мМ -меркаптоэтанола) в течение 40 мин при 37 С. После нагревания при 65 С 45 в течение 10 мии ДНК фрагменты помещают на 5Х-ный акриламидный гель (акриламид .бис отношение 19:I) вместе с соответствующим маркером размера. Целевой 46bp фрагмент, по50 лученный Нрав? частичным выжиганием
135Ър фрагмента, очищают стандартным способом.
0,2 мкг XbaI-.PVUII фрагмента плаэмидного вектора, 3,2 пмоль синтетического 63Ър фрагмента и 0,5 пмоль
46bp фрагмента инкубируют в 10 мкл лигирующего буфера с 2 ед. Т4 ДНК лигаэы в течение 16 ч при 4 С, Лигирующую смесь использун т для рансф рмации Е.сoli JA221, Полученные трансформанты, которые содержат целевую плазмиду р11М789, отбирают на устойчивость к ампициллину. Идентичность с плазмидой pNM789 подтверждена обычным скринированием на наличие
494bp PNII и 109bp XbaI-PVUII фрагментов.
Плазмида рНМ789 требует изменения одного аминокислотного кодона для полного превращения в бычий гормон роста, что осуществляют удалением
28bp PVUII до BamHI фрагмента pNM789 и заменой синтетическим двухнитевым фрагментом, имеющим следующую последовательность:
5 CTGTGCCTTCTAC 3
3 GACACGGAAGATCCTAG 5
10 мкг рЯ1789 выжигают l ед.
PVUII в 200 Mrcsl PVUII буфера в течение 5 мин при 37 С. После нагревания в течение 10 мин при 65o C полученную смесь разбавляют до 300 мкл с добавлением BamHI буфера, выжигают до завершения 10 ед. BamHI в течение часа при 37 С, обрабатывают 5 ед. щелочной фосфатазы и инкубируют в тече- ние часа при 650C. jjHK фрагменты разделяют íà 1Х-ном агарозном геле; ДНК фрагмент размером плазмиды рКМ789 с единичным разрывом очищают обычным способом. 0,02 мкг этого фрагмента лигируют 5 пмоль синтетического фрагмента, используя.2 ед. Т4 лигаэы в
20 мкл лигазного буфера. Лигирование осуществляют в течение ночи при 4 С.
После трансформации несколько плаэмид вьщеляют и скринируют на соответствующие PVUII (494Ьр) и XbaIBamII (628bp) фрагменты. Плазмнды, содержащие указанные выше фрагменты, составляют целевую плазмиду рНМ789В.
Пример 2. Бактерию Е.coli
К12/pIM-II-АЗ/NRRI.Â-15733) культивируют в TV бульоне (1X триптона, 0,5Х дрожжевого экстракта, 0,5Х хло" ристого натрия; рН 7,4) с 90 мкг/мл канамицина при 25оС в соответствии с обычной микробиологической процедурой. После этого культуру разбавляют 1:10 в свежем бульоне, после трех часов инкубирования при 37 С 0,5 мл культуры переносят в 1,5 мл ампулу
Эппендорфа и центрифугируют в течение 15 с. Если нет других указаний, все манипуляции осуществляют при комнатной температуре. Полученную над1491346
16 осадочную жидк ость о сторожно удаляют аспиратором с острым концом. Клеточную массу повторно суспендируют в
&00 мкл свежеприготовленного лиэо5 цимного раствора (2 мкг/мл), который содержит 2 мкг/мл лизоцима, 50 мИ глюкозы, 10 мИ ЕТДА (диаминтетраацетат) и 25 мИ Tris НС1, рН 8. Добавляют ".200 мкл щелочного SDS (натрий- tp додецилсульфат) раствора (0,2 NaOH, 1Х SDS) и осторожно переворачивают ампулу, а затем выдерживают при 0 С до завершения лизиса (примерно
5 мин). Затеи добавляют 150 мкл 3 М натрийацетата и осторожно смешивают содержимое ампулы, переворачивая ее в течение нескольких секунд.
-Ампулу выдерживают при 0 С в течение по крайней мере 60 мин, а 20 затем центрифугируют в течение 15 мин до получения почти прозрачной надосадочной жидкости, Надосадочную жидкость переносят во вторую ампулу центрифуги, в которую добавля- 25
Ъ ют 3 объема холодного 100Х-ного этанола. После вьщерживання ампулы на смеси сухой лед — этанол в течение
5 мин полученный осадок собирают центрифугированием (5 мин), надоса- 30 дочную жидкость удаляют отсасыванием.
Собранную массу раствор1пот в 100 мкл
TE (10 мИ Tris. НС1 рН S 0; 1 мИ ЕДТА) .
Получают целевую ДНК р?М-1 -АЗ плазмиды. 35
Около 5 мкл плазмиды pNM789B .ДНК в 50 мкл HiSalt буфера инкубируют с 10 ед. каждого (BamHI и XbaI) рестрикционного фермента при 37 С в те- 40 чение 1 ч. После добавления 5 мкл
ЗИ ацетата натрия (рН 8,0) ДНК осаждают 3 объемами 100Х-ного этанола, Целевой ДНК диджест растворяют в
100 à ТЕ буфера и хранят при 0 С 45 для дальнейшего использования, 6АО 6АТ САТ ТАА АТЮ ТТС CCA gCC
Е ° Е Е ЕЕ ttl ЕЕ ЕЕЕ ЕЕЕ» ФФ1 ЕФЕ
CTC CTA CTA АТТ ТАС ААС ССТц CCL
ССС ААС GCT ЮТССТ Зе
tII III III I
CCr, ТТС CCA C S
5 СТЛСАСССТАТТЛАТА АТС ПИТТС, li t liltttttttttt ftl еЕI
3 7CCCATAATTAT ТАС AAC
АТ9 ТСС TTC TCC ССС СТС TTT
ТАС АСС AAC АСС CCC САС AAA
Целевую линкерную последовательность синтезируют обычным модифицированным фосфотриэфирным способом.
Около 200 пмоль ДНК линкера примера 3, 1 мкг плазмиды рСЕ101
Около 1 мкг выварки плазмиды
pIM-I -АЗ, 1 мкг выварки плазмиды
pNM789B XbaI-BamHI, 40 мкл воды, 5 мкл (5 мИ) АТП, 5 мкл лигирующей смеси и 5 ел. Т4 ДНК лигазы инкубируит при 20 С в течение 2 ч. После о" инкубирования при 65 С в течение
2 мин с последующим клонированием на льду полученную смесь лигирования используют для трансформации
К12КЧ308 Hà TV пластинах (1X триптона, 0,5Х дрожжевого экстракта, 0,5Х хлористого натрия, 1,5Х агара, рН 7 » содержащих 50 мкг/мл канамицина.
Некоторые из полученных трансформантов (что можно легко показать обычным электрофорезом на агарозном геле и другими тестами) содержат только целевую 10,8kb плазмиду.
Полученные клетки используют для выделения плазмиды pCZ101.
Пример 3. Целевой фрагмент конструируют практически по способу примера 2, за исключением того, что вместо плазмиды рНИ789В используют плазмиду рСЕ101. Целевой
10,2kb BamHI-ХЬаТ рестрикционный фрагмент обычным способом выделяют и изолируют с помощью электрофореза на агарозном геле, затем растворяют в 100 мкл ТЕ буфера и хранят при
О С для дальнейшего использования.
Целевой фрагмент конструируют по способу примера 2 за исключением того,. что вместо плазмнды pNM789B и XbaI рестрикционного фермента используют плазмиду pCZ101 и HgiAI рестрикционный фермент. Целевые 0,6kb BamHI-HgiAI рестрикционные фрагменты выделяют обычным способом с помощью электрофореза на агарозном геле, затем растворяют в 100 мкл ТЕ буфера и хранят при 0 С для Дальнейшего использования, 10,2kb BamHI-XbaI фрагмента и
0,5 мкг плазмиды рСЕ101 "-0,6kb
BamHI-HgiAI фрагмента лигируют, полученную плазмиду используют дпя
14913 »
17 тельность
ATG Ттс CCA ТТЬ GAT GAT GAT TAA ATG ТТС !
1!!!rrr!!!!!!!!!!r!r,!!!!!r.!!!
ТАС AAG GGT AAC СТА СТА СТА АТТ ТАС AAG
ТСС GGC CTG ттт GCC AAC ССТ GTGCT 3 ! !!! !!! !1! !!! rrr r!! r! rr !!!
AGG C CG САС ААА CGG ТТС CGA С 5
5 CTAGAGCGTATTAATA !!!!!!!!!!!
3 ТСССДТААТТАТ
ССА GCC ATG ТСС ТТС
rrr !!! rr! У!! !!
ИТ ССС ТАС AGG ААС трансформирования Е,coli К12 КЧ308 по способу примера 2.
Некоторые из полученных трансформантов (что легко показать с помощью электрофореза на агарозном геле и других тестов) содержат только целевую 10,8kb плазмиду. Такой трансформант, обозначенный E.coli
K12RV308/pCZ114, отбирают, помещают на TV агар, содержащий соответствующие антибиотики, а затем культивируют в соответствии с обычными микробиологическими методиками. Как было показано с помощью SDS гель1
Целевые трансформанты, обозначенные Е.coli К12-RV308/pCZ101,1, помещают на TV агар, содержащий соответств нч ие антибиотики, а затем обычным способом культивируют. Выделяют плазмиду pCZ101,1. Как показано с помощью SDS гель-злектрофореэа, R1A и других тестов, траисформант;: осуществляют экспрессию met-bGH с высокими уровнями. Так как плазмида рСЕ101,1 содержит термоиндуцируемый репликон "ускоренного роста", мак- 35 симальная экспрессия met-bGH происходит при культивировании при температуре 37 С.
Пример 5, Плазмида pGMI содержит Е.coli триптофановый опе- 40 рон, содержащий исключение >ZE1413.
Следовательно, экспрессирует литый протеин, содержащий первые 6 аминокислот trp лидера и приблизительно последнюю треть trpE полипептида 45 (здесь и далее для краткости обозначаемого ZE ), а также trpD полипепг тид целиком (все под контролем trp промотор/операторной системы).
Около 20 мкг плазмиды выжигают рестрикционным ферментом PNUII, который расщепляет плазмиду по 5 сайтам. Генные фрагменты объединяют
EcoRI линкерами, состоящими иэ самокомплементарных лигонуклеотидов последовательности рСАТСААТТСАТС, обеспечивая EcoRI саит расщепления для последующего. клонирования в плаэмиду, содержащую EcoRI сайт. электрофореэа, kIA n других тестов, полученные клетки экспресспр<вали
met-bGH в болы и>м количс ство. Так как плазм . а р(;7.114 содержит тернов индуиированный репликон ускоренного роста, максимальная экспрессия тпег.ЬГН наблюдается при температуре выращивания культуры около 37 С.
Пример 4. Целевое конструирование осуществляют в соответствии с методикой примера 3 с тем отличием, что вмес1о линкерной последовательности примера3 используют последова20 мк г ДН К фра гмен то в, полученных из рСМ?, обрабатывают 10 ед.
Т4 ДНК лигазы в присутствии 200 пмоль
5 -фосфорилированного синтетического лигонуклеотида рСАТСААТТСАТС и
20 мкг Т4 ДНК лигазного буфера (20 мМ Tris, рН 7,6; 0,5 мМ АТР, 10 мМ MgClg 5 мМ дитиотретиола) при
4 С в течение ночи. Затем раствор нагревают в течение 10 мин при 70 С для остановки лигирования. Линкеры расщепляют EcoRI выжиганием, фрагменты (теперь уже с EcoRI концами) выделяют, используя 57.-ный полиакриламидный гель-злектрофореэ. Три самых крупных фрагмента выделяют иэ геля, вначале окрашивая этидиумбромидом, затем определяя положение фрагментов под действием ультрафиолетового излучения и выражая из ге-, ля участки, представляющие интерес.
Каждый из фрагментов геля с 300 мкл
0,1МТВЕ помещают в камеру для диализа и подвергают электрофорезу при 100 Р..в. течение часа в 0,1 хТВЕ буфере (TBE буфер содержит
10,8 г Tris основания, 5,5 г борной кислоты, 0,09 r Na EljTA в 1 л Н О).
Водный раствор выбирают иэ камеры. для диализа, экстрагируют фенолом, хлороформом и доводят до 0,2М по отношению к хлористому натрию. 3атем ДНК выделяют в воде после осаждения этанолом, Фрагменты, содержащие trp промотор/оператор с EcoRI липкими концами, идентифицируют пуl9
1491346
Отбирают несколько устойчивых к тетрациклину колоний, вьщеляют плазмидную ДНК и обозначают pBRHtrp.
Наличие целевого фрагмента подтвер- 45 ждается рестрикционным ферментным анализом, Плазмидный pBRHtrp экспрессирует -лактамазу, придает устойчивость к ампициллину и содержит
50 промо то р/оператор. ДНК фрагмент также кодирует, первый протеин (обозначенный ZE), содержащий "сшивку" первых шести аминокислот trp лидера и приблизительно последнюю треть
trpE полипептида; второй протеин (обозначенный D), соответствующий приблизительно первой половике trpD полнпептнда, и третий протеин, котем включения в чувствительную к тетрациклину плазмиду, которая после включения промотор/оператора становится устойчивой к тетрациклину,.
Все вьщеления ДНК фрагмента, описанные здесь и далее, в этом примере осуществляют с применением РАСЕ с последующим электроэлюированием, описанным выше.
Плазмида pBRHI экспрессирует устойчивость к амипициллину и содержит ген устойчивости к тетрациклину, но так как в ней нет связанного промотора, не экспрессирует эту устойчивость. Клетки, в которых находится плазмида, соответственно, являются чувствительными к тетрациклину.
Если ввести промотор/операторную систему в EcoRI сайт, плазмида будет экспрессировать устойчивость к тетрациклину.
Плазмиду рВКН? дигерируют Есор?.
Фермент, удаляют, экстрагируя фенолом, а затем хлороформом. ДНК повторно суспендируют в воде после осаждения этанолом. Полученную ДНК в отдельных реакционных смесях объединяют с каждым из трех ДНК фрагментов, полученных в примере 5, и лигируют с Т4 ДНК лигазой, как было описано ранее. ДНК, присутствующую в реакционной смеси, используют для трансформации компетентной Е.coli
К12294/NPPZB-15625/ с помощью, стандартной методики, затем бактерии помещают на пластины ЕВ, содержащие
20 мкг/мл ампициллина и 5 мкг/мл тетрациклина.
1О
40 дирующий ген устойчивости к тетрациклину.
Плазмиду pBRHtrp выжигают EcoRI рестрикционным ферментом. Полученный фрагмент, вьщеленный с помощью РАСЕ и электроэлюирования, объединяют с
EcoRI, выжженной плазмидой pSOMII.
Полученную смесь лигируют Т4 ДНК лигазой, полученную ДНК трансформируют в Е.cali K12 294, как было описано ранее. Трансформантную бактерию выбирают на пластинах, содержащих ампициллнн, Полученные колонии устойчивые к ампициллину, скринируют путем гибридизации. Фрагмент, содержащий trp промотор/оператор, вьщеленный из pBRHtrp, а затем меченный радиоактивно P" используют в вышеописанной процедуре в качестве зонда. Некоторые положительные при гибридизации колонии отбирают. Выделяют плазмидную ДНК. Ориентацию вставленных фрагментов определяют рестрикционным анализом, используя ферменты BgIII u BamHI в двойном выжигании. Колонии, содержащие целевую плазмиду с фрагментом trp промотор/ оператор в соответствующей ориентации, выращивают на ZB среде, содержащей 10 мкг/мл ампициплина. Целевую плазмиду обозначают рЯОМ7а2 и используют для последующих конструкций, описанных далее.
Плазмиду pSOM752 выжигают HindIII, а затем лямбда-экзонуклеазой (5 до 3 экзонуклеаза) в условиях, выбранных так, чтобы выжигание произошло позади BglII рестрикцнонного сайта внутри ZE кодирующего участка. Около 20 мкг HindIII выжженной рБОМ7Л2 растворяют в буфере (20 мМ глицин- ного буфера, рН 9,6; 1 мМ MgClg, 1 мМ -меркаптоэтанола). Полученную смесь обрабатывают 5 ед. лямбда-экзонуклеаэы в течение 60 мин при комнатной температуре. Реакционную смесь, полученную при этом, экстрагируют фенолом, хлороформом и осаждают этанолом»
Для получения EcoRI остатка у дистального конца ZE генного фермента синтезируют праймер РССТСТССАТСАТ
32 усовершенствованным фосфотриэфирным способом и гибридизируют с однонитевым концом ЕЕ генного фрагмента, полученного при выжигании лямбдаэкэогенаэой. Гндридиэацию проводят, растворяя 20 мкг обработанного лямб2I
1491346
Олигодеоксирибонуклеотиды Т -Т, синтезированные модифипированным фосфотриэфирным способом, представлены в табл. 1.
55 да-зкзогеназой. Гибридизацию проводят, растворяя 20 мкг обработанного лямбда-зкзогеназой продукта выжигания
HindIII плазмиды рБОМ7Л2 в 20 мкл
Н О и объединяя с 6 мкл раствора, содержащего 80 пмоль 5 -фосфорилированного олигонуклеотида, описанного ранее. Синтетический фрагмент гибридизируют с 3 концом 7Е коди- 10 ( рующей последовательности, а остальную однонитевую часть ZF. фрагмента заполняют полимеразой Кленова I, используя dATP dTTP dCTP и dCTP, Полимераза Кленова I является фрагментом, полученным при протеолитическом расщеплении ДНК полимеразы I.
Она соде,ржит 5 — 3 полимернзующую активность, 3 — 5 экзонуклеотичесI ( кую активность, но не 5 -3 экзоI
20 нуклеотическую активность исходного фермента.
Затем реакционную смесь нагревают до 50 С и оставляют медленно остывать, после чего добавляют 4 мкл 25 фермента Кленова. После инкубирования 15 мин при комнатной температуре, затем 30 мин при 37 С реакцию останавливают, добавляя 5 мкл 0,25 М
ЕДТА. Реакционную смесь экстрагиру- 30 ют фенолом, хлороформом и осаждают этанолом. ДНК последовательно расщепляют рестрикционным ферментом
BgIII. Полученные фрагменты разделяю