1493952 - Способ определения содержания белка

Способ определения содержания белка

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к микробиологической и комбикормовой промышленности и касается методов контроля содержания истинного белка непосредственно в кормовых дрожжах или в кормосмесях. Цель изобретения - повышение точности определения белка. Способ заключается в том, что проводят предварительную обработку образца ацетоном при 15-55°С в течение 15-30 мин и при отношении исходного образца и растворителя не более 0,5-1,0%, после чего ацетон удаляют, а инкубацию образца с раствором красителя амидочерного 10В проводят при 50-100°С в течение 10-30 мин в дистиллированной воде, причем добавление красителя осуществляют с установлением PH с помощью HCL в пределах 1-3 с последующим фильтрованием и измерением оптической плотности фильтрата при 590 нм. Предлагаемый способ позволяет количественно определять белок в биомассе микроорганизмов с высокой точностью. 12 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

ССН4ИАЛИСТИ1ЕСКИХ

РЕСПУ БЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4258459/30-13 (22) 08 ° 06.87 (46) 15.07,89 .Бюл. У- 26 (71) Всесоюзный научно-исследовательский и проектно-конструкторский институт микробиологических производств (72) С.Л.Романов, В.В.Котусов, В.В,Орлов, Н.К.Белоцерковская и Н,А.Щербак (53) 577 ° 15(088.8) (56) Бузун Г.А., Джемухадзе К.H., % лешко Л.Ф. Определение белка в растениях с помощью амидочерного.

Физиология растений, 1982, 29,1, с. 198-204..(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ

БЕЛКА (57) Изобретение относится к микробиологической и комбикормовой промышленности и касается методов контИзобретение относится к микробиологической и комбикормовой промышленности и касается, методов контроля содержания истинного белка непосредственно в кормовых дрожжах или в кормосмесях, Целью изобретения является повьш ение точности определения белка, Изобретение заключается в том, что предварительную обработку сухого препарата (биомассы микроорганизмов или продукта микробного синтеза) проводят ацетоном при 15-55 С в течение 15-30 мпн, удаляют ацетон, инкубирун т прс парят при 50-100 С в

„„SU„„1493952 А1 (51)4 G 01 N 33/48 А 23 J 1/00

2 роля содержания истинного белка непосредственно в кормовых дрожжах или в кормосмесях. Цель изобретения вЂ” повышение точности определения белка.

Способ заключается в том, что проводят предварительную обработку образца ацетоном при 15-55 С в течение

15-30 мин и при отношении исходного образца и растворителя не более 0 51,0%, после чего ацетон удаляют, а инкубацию образца с раствором красителя амидочерного 10В проводят при

50-100 С в течение 10-30 мин в дистиллированной воде, причем добавление красителя осуществляют с установлением рН с помощью НС1 в пределах

1-3 с последующим фильтрованием и измерением оптической плотности фильтрата при 590 нм. Предлагаемый способ позволяет количественно определять белок в биомассе микроорганизмов с высокой точностью, 12 табл ° течение 10-30 мин в растворе красителя амидочерного 10В в подкисленной с помощью НС1 дистиллированной воде до рН 1-3, а затем фильтруют и измеряют оптическую плотность фильтрата.

В качестве стандартного препарата используют биомассу микроорганизмов или продукт микробного синтеза с заранее определенным содержанием белка с помощью известного метода, например по Барнштейну.

Для определения связывания красителя амидочерного 10В с анализируемым препаратом берут небольшое количество этого препарата (около ?О г),тщау вЂ” В

С = -- вЂ” вЂ” вЂ” 100Z9

Ах где С

У содержание белка; значение связывания красителя с белком; соответствующее этому связыванию значение концентрации

55 анализируемого препарата;

14939 тельно растирают в фарфоровой ступке пестиком в течение 10 мин и высушивают при 105" С до постоянного веса (хранят препарат в стеклянном бюксе .с притертой крышкой). Затем делают

5 необходимую навеску препарата, добавляют 15 мл ацетона и перемешивают при комнатной температуре (см.табл.1) в течение 15 мин (см.табл.2) на магнитной мешалке, После этого суспенэию центрифугируют в течение 15 мин при

7000-8000 об/мин, ацетон удаляют декантацией, а осадок высушивают при комнатной температуре в течение 15

5-10 мин. К высушенному от ацетона препарата добавляют 0,01 н НС1, рН 2 (см.табл.3,4) до концентрации пре.парата 5 мг/мл и перемешивают при комнатной температуре на магнитной 2р мешалке в течение 15 мин, Затем не прекращая перемешивание, разносят аликвоты суспензии по пробиркам,доводя объем до 1,5 мл с помощью 0,01 н

НС1, и добавляют в каждую пробирку 25 по 3 мл раствора красителя амидочерного 10В 0,6 г/л в 0,01 í НС1. Далее пробирки помещают в термостат и инкубируют при 60 С (см,табл,5) в течение 20 мин (см,табл.6) при пере- 3р мешивании. После инкубации фильтруют все образцы и контроль (раствор красителя без препарата) через бумажные фильтры на воронках. Фильтраты разбавляют в 25 раз, для чего к 0,2 мл фильтрата добавляют 4,8 мл 0,01 н

НС1, а затем измеряют оптическую плотность D при 590 нм в стеклянных кюветах с длиной оптического пути

1,0 см против 0,01 н НС1. Далее оп- 40 ределяют разницу й0 между оптическими плотностями контроля и опытного образца, Связывание красителя с анализируемым препаратом (разницу между оптическими плотностями) выражают в процентах от оптической плотности фильтрата контроля.

Содержание истинного белка в продуктах микробного синтеза и биомассе микроорганизмов определяют по форму50 ле

А и В вЂ” эмпирические коэффициенты уравнения калибровочной прямой (у=Ах+В), рассчитанные с помощью метода наименьших квадратов из нескольких параллельных опы- тов по связыванию красителя амидочерного 10В со стандартным препаратом (биомассой микроорганизмов или продуктом микробного синтеза), содержание белка в котором определено с помощью известного метода, например по Барнштейну или по данным аминокислотного анализа.

В табл.1 показано влияние температуры обработки ацетоном препарата кормовых гидролиэных дрожжей с кон- . центрацией 5 мг/мл на связывание красителя амидочерного 10В с ними.

В табл,2 показано влияние времени обработки ацетоном препарата кормовых гидролизных дрожжей на связывание красителя амидочерного 10В с ними.

В табл.3 показано влияние рН раствора красителя амидочерного 10В íà его связывание с кормовыми гидролизными дрожжами, В табл.4 показано связывание кра сителя амидочерного 10В с кормовыми гидролизными дрожжами в зависимости от состава растворителя.

В табл.5 показано влияние температуры инкубации кормовых гидролизных дрожжей с красителем амидочерным 10В на его связывание с дрожжами.

В табл.6 показано влияние времени инкубации кормовых гидролизных дрожжей с красителем амидочерным 10В на его связывание с ними.

П ри ме р. Первоначальным этапом определения белка по предлагаемому способу является определение эмпирических коэффициентов калибровочной прямой (у = Ах + В), т.е. зависимости связывания красителя амидочерного 10В со стандартным препаратом от концентрации в этом препарате истинного белка, который определяли по Барнштейну.

В качестве стандартного препарата для определения белка в биомассе микроорганизмов мы использовали кормовые гидролизные дрожжи с содержанием белка в расчете на сухой вес 41,42Х. Эмпирические коэффициенты А и В определяли по методу наименьших квадратов

5 по данным 5 параллельных опытов (см. табл. 7):

1493952

Содержание белка в анализируемых препаратах определяли по формуле

30,07 °

N х - (х;)

= 8,11 где А и В вЂ” эмпирические коэффициенты калибровочной прямой1 х; вЂ” концентрация белка в стандартном препарате; у вЂ” опытные значения свяэыl вания красителя с препаратом, соответствующие х;, N вЂ” - число измерений.

В табл.7 показано связывание красителя амидочерного 10В со стандартным препаратом кормовых гидролизных дрожжей.

Содержание белка в анализируемых препаратах определяли по формуле ч вЂ” 8 11

С = - вЂ” вЂ” ь вЂ” вЂ” 100

30,07 х

В качестве анализируемого препарата взяли дрожжи (кормовые гидролиз- 30 ные) с неизвестным содержанием белка (см.табл,8), В табл.8 показано связывание красителя амидочерного 10В с анализируемым препаратом кормовых гидролиз35 ных дрожжей.

В результате проведенных расчетов получили следующие значения содержания белка в анализируемом препарате кормовых гидролиэных дрожжей: 40

С, = 39,99Х; С q = 42,97 .; С э= 41,51 ;

С = 41,49 + 0,63 .

Таким образом, содержание белка в анализируемом препарате кормовых 45 гидролизных дрожжей составляет

41,49 °

Для определения содержания белка в продукте микробного синтеза в качестве стандартного препарата использовали дрожжеванную ржаную муку с содержанием белка по Барнштейну

10,62 (см,табл.9) и белково-витаминный концентрат (БВК) с содержанием белка 55,13% (см,табл,11).

В табл.9 показано связывание кра-i сителя амидочерного 10В со стандартным препаратом дрожжеванной ржаной муки. у -029

С = вЂ” вЂ” вЂ” - -- ° 100X

35,63 . х

В качестве анализируемого препарата мы использовали дрожжеванную ржаную муку (см.табл.10) с неизвестным содержанием белка.

В табл.10 показано связывание красители амидочерного 10В с анализируемым препаратом дрожжеванной ржаной муки.

В результате проведенных расчетов получили следующие значения содержания белка в анализируемом препарате:

С,= 11,07 .; С g = 11,28 .; С = 11,19 ;

Сср 11 18 + 0,07X

Таким образом, содержание белка в анализируемом препарате дрожжеванной ржаной муки составляет 11,18%.

В табл.11 показано связывание красителя амидочерного 10Â со стандартным препаратом белково-витаминного концентрата.

Содержание белка в анализируемых препаратах белково-витаминных концентрациях определяли по формуле у вЂ” 14 52

С = вЂ” вЂ” вЂ” вЂ” - 100X.

27,09 х

В качестве анализируемого препарата испольэовали белково-витаминный концентрат (см.табл,12) с неизвестным содержанием белка.

В табл.12 показано связывание красителя амидочерного 10В с анализируемым препаратом белково-витаминного концентрата.

В результате проведенных расчетов получили следующие значения содержания белка в анализируемом препарате .белково-витаминного концентрата:

С, = 56,451; С g = 55,88Х; С = 55 ° 96X>

Сср= 56э to + Оъ24X °

Таким образом, содержание белка в анализируемом препарате БВК составляет 56,101.

Формула изобретения

Способ определения содержания белка, предусматривающий предварительную обработку исходного образца, добавление к нему красителя амидочерного 10В с одновременным регулирова- нием рН среды, инкубирование, удале1493952 исходного образца и растворителя

0,5-1,0, после чего ацетон удаляют, а инкубацию образца с раствором кра5 сителя проводят при 50- 100 С в течение 10-30 мин в дистиллированной воде, при этом добавление красителя осуществляют с установлением рН с помощью НС1 в пределах 1-3.

Таблица 1 ние осадка с последующим спектрофотометрическим анализом надосадочной фракции v расчетом содержания белка, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения белка, предварительную обработку образца проводят ацетоном при 15-55 С в течение 15-30 мин и при отношении

РУ Время об- Температура D и/п работки обработки, С мин

Связывание красителя, Х

1 к

3 15

4 15 .5 15

6 15

7 15

8 15

9 15

10 15

11 15

12 15

1,25

0,76

0,72

0,64

0,55

0,51

0,45

0,46

0,48

0,51

Контроль (раствор красителя беэ дрожжей).

Опыт без предварительной обработки ацетоном.

Температура кипения ацетона 56,2 С.

Таблица 2

РР Температу- Время обра- D п/п ра обработ- ботки,мин ки, С

Связывание красителя, Х

Таблица 3

Связывание красителя, Х рН раствора красителя

Ю и/п

Оптическа» плотность контроля не зависела от рН в исследованном диапазоне.

1,00

0,04

0 05

0,22

0,34

0,53

1,26

0,76

0,71

0,56

0,45

0,47

0,49

0,48

0 56

0,96

0,95

0,78

0,66

0,47

0,49

0,53

0,61

0,7,0

0,74

0,80

0,79

0,77

10, 77

0,74

0,49

0,54

0,69

0,80

0,78

0,76

0,77

0 69

100,0

108, 2

124,5

142,9

151,0

163,3

161,2

157,1

157, 1

151,0

100,0

110,2

140,8.

163,3

159,2

155,1

157,1

140 8

1493952

Таблица 4

Концентрация препарата, мг/мп

УР . п/п

0,01 н НС1 Буферный раствор

63,30

54,20

45, 1О

62,50

54,35

45,65

4,5

3,5

3,0

Буферный раствор содержал 37,65 г/л лимонной кислоты и 1, 136 г/л Na ÍÐÎ .

Таблица 5

Связывание красителя, Х

Время ин- Температура кубации, инкубации, С мин

УВ

n/è

1,20

0,89

0,70

0,54

0,56

0,57

+ Оптическая плотность контроля не зависела от температуры в исследованном диапазоне.

Таблица 6

99 Температура Время инп/п инкубации, кубации, С мин

Связывание красителя, Х

Таблица 7

Концентрация, мг/мл г белка

Ф п/п

Связывание красителя с препаратом " Х препарата

69, 10+1, 24

62,85т0,87

58,25+1,32

52,9510 80

46,5010,76

37,05 1,00

33,0811,03

2,06

1,85

1,64

1,44

1,23

1,03

0,82 В таблице представлены усредненные значения связывания, полученные из

5 опытов

5,0

4,5

4,0

3,5

3,0

2,5

2,0

100

1,20

0,91

0,70

0,65

0,55

0,60

0,62

0,83

0,89

0,31

0 50

0,66

0,64

0,63

0,29

0 50

0,55

0,65

0,60

0,58

0,37

0,31

25,8

41,7

55,0

53,3

52,5

24,2

41,7

45,8

54,2

50,0

48,3

30,8

25,8

1493952

Таблица 8

Связывание красителя, 7

Концентрация препарата, мг/мл

Ф1В п/п

0,56

62,22

0,90

0,34

0,40

0,44

0,50

0,48

4,5

3,5

3,0

0,34

0,48

53,33

45,56

0,42

0,41

0,49

Таблица 9

Связывание красителя с препаратом, Х

УР п/п белка препарата

1,06

0,96

0,85

0,74

0,64

0 53

0,42 В таблице представлены усредненные значения связывания, полученные из 5 опытов.

Таблица 10

Связывание красителя, X п,р

Концентрация препарата, мг/мл

99 п/п

35,679

0,34

0,61

0,68

0,27

28,42

24,21

0,23

0,72 блица 11

Фг

В таблице представлены усредненные значения связывания, полученные из 5 опытов.

5,0

4,5

4,0

3,5

3,0

2,5

2,0

2,76

2,48

2,20

1,93

1,65

1,38

1, 10

0,95

0,60

0,62

0,68

0,71

0,73

38,49+1,04

34,46+1,00

29,87+0,68

27,09+0,29

22,44+0,34

19,00+0,37

15,98ф0,24

87,40 0,96

82, 1110,82

75,82+0,85

66,31+0,79

60,03т0,61

53,72ф0,80

42,11+0,81

1493952

Таблица 12

Связывание красителя, 3 ср

Концентрация препарата, мг/мл

ФР и/и

83,33

1,00

0,20

67,50

60, 00

0,81

0,39

0,48 0,72

Редактор И.Циткина

Заказ 4103/42 Тираж 789 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул. Гагарина, 101

4,5

3,5

3,0

1,20

0,19

0,21

0,40

0,38

0,48

Составитель В.Варламов

ТехРед Л.Олийнык Корректор Л.Патай

Способ определения содержания белка

Патент 1493952