Способ получения препарата для определения моноаминов на основе иммобилизованной моноаминооксидазы

Способ получения препарата для определения моноаминов на основе иммобилизованной моноаминооксидазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению иммобилизованных органоидов клетки и ферментов, и может найти применение при получении биокатализаторов, а также в химическом, клиническом и токсилогическом анализе. Цель изобретения - улучшение характеристик препарата для определения моноаминов за счет повышения активности моноаминооксидазы, механической прочности и антимикробных свойств пленки. Способ заключается во введении ферментного препарата с моноаминооксидазной активностью (гомогенат митохондрий печени) в водный раствор желатина с последующим добавлением террилитина в количестве 1-10 протеолитических единиц на 1 мл суспензии, немедленном нанесении суспензии на нерастворимую подложку, высушивании суспензии на воздухе и обработке полученной пленки в течение 3-5 мин глутаровым альдегидом. Полученный препарат обладает повышенными механической прочностью и антимикробными свойствами, а также в 1,5 раза более высокой активностью моноаминооксидазы. 1 з.п. ф-лы. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ.

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) А1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР! (21 ) 4290684/28-1 3 (22) 27.07.87 (46) 23.07 ° 89. Бюл. ¹ 27 (71) Научно-производственное объединение "Биолар" и Латвийский государственный университет им. П. Стучки (72) Д. IO.,Iaëöåðå, Б. А. Гринберг, А. А. Прикулис, Е. Б. Никольская, А. В. Святковский и О. В. Ягодина (53) 577.15(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР № 1146322, кл. С 12 N 11/12, 1983.

Durand. P. et al. An enzyme electrode Biophys. — Biochim Acta, 1978, 2, 277-281. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ДЛЯ

ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОНОАМИНОВ НА ОСНОВЕ ИИИОБИЛИЗОВАННОЙ ИОНОАМИНООКСИДАЗЫ (57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению иммобилизованных органоидов клетки и ферментов, и может найти применение при получении биокатализаторов, а также

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к области получения иммобилизованных органоидов клетки и ферментов, и может найти применение при получении биокатализаторов, а также в химическом, клиническом и токсикологическом анализе.

Целью изобретения является улучшение характеристик препарата дпя определения моноаминов за счет повышения активности моноаминооксидазы (MA0), механической прочности и антимикробных свойств пленки. (51) 4 С 12 N 11/12 G 01 N 33/50

2 в химическом, клиническом и токсило гическом анализе. Цель изобретения улучшение характеристик препарата дпя определения моноаминов за счет повышения активности моноаминооксидазы, механической прочности и антимикробных свойств пленки. Способ заключается во введении ферментного препарата с моноаминооксидазной активностью (гомогенат митохондрий печени) в водный раствор желатина с последующим добавлением террилитина в количестве 1-10 протеолитических единиц на 1 мл суспензии, немедленном нанесении суспензии на нерастворимую подложку, высушивании суспензии на воздухе и обработке полученной пленки в течение 3-5 мин глутаровым альдегидом. Полученный препарат обладает повышенными механической прочностью и антимикробными свойствами, а также в 1,5 раза более высокой активностью моноаминооксидазы. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

Способ заключается во введении ферментного препарата (гомогената. митохондрий печени) в водный раствор желатина с последующим добавлением террилитина в количестве 1-10 протеолитических единиц на I мл объема суспензии, немедленном нанесении полученной суспензии на нерастворимую подложку, высушивании суспензии на воздухе и обработке полученной пленки глутаровым альдегидом (предпочтительно в течение 3-5 мин) ° Введение террилитина приводит к частичному

3 149537 разрушению митохондриальных мембран, что увеличивает активность моноаминооксидазы. Кратковременность воздействия террилитина на моноаминооксидазу (до высушивания пленки) позволяет избежать ее инактивации за счет протеолиза. Способ позволяет получить целевой продукт с улучшенными характеристиками: активность иммобилизованной моноаминооксидазы возрастает в 1,5 раза, увеличивается также прочность пленки и ее бактериостатическое действие.

Пример 1. 0 2 r желатина 15 помещают в стаканчик с 4 мл дистиллированной воды для набухания. Затем туда же добавляют 5 мл 0,05 M фосфатного буфера с рН 7,4 и нагревают при перемешивании до полного растворения 20

° желатина. Далее раствор охлаждают до о

+25 С и вносят в него 2 r гомогената митохондрий печени свиньи в 0,05 M фосфатном буфере, рН 7,4 и перемешивают. К полученной суспензии добавля- 25 ют 1 мл раствора террилитина в воде с суммарной активностью 10 протеолитических единиц (ПЕ), т.е. 1 ПЕ/1 мл состава. Смесь немедленно порциями по

5 мл выливают на ровную поверхность полиэтиленовой пластины и высушивают в потоке воздуха в течение 1,5 ч. Су.хую пленку желатина обрабатывают

10 мл 2Х-ного раствора глутарового альдегида (ГА) в течение 3 мин. После 35 этого избыток раствора ГА сливают, а пленку многократно промывают водой и

0,05 М фосфатным буфером, рН 7,4, и снова высушивают в потоке воздуха в течение 1 ч. Сухие препараты хранят 40 о в холодильнике при 4-10 С. МАО активность диагностического препарата:

6,83 10 Е/мг белка (по тирамину);

-Ф

5,60 10 Е/мг белка (по серотонину); 45

4,65 ° 10 E/ìã белка (по бензиламину) .

Активность препарата сохраняется в течение года.

Бактериостатическая активность.

Задержка роста культуры кишечной палочки в пробах с пленкой полученного диагностического препарата по сравнению с контролем 86,4Х.

Механическая "îõðàííîñòü в условиях многократного использования: препарат стабилен в 50 циклах работы.

Один цикл работы — пять дней по пять определений в день. После каждого

8 4 цикла работы препарат высушивается на воздухе и взвешивается.

Характеристики препаратов приведены в табл. 1.!

За единицу протелитической активности террилитина принято такое количество фермента, которое расщепляет 1 смоль субстрата за 1 мин при

+25 С и рН 7,0.

Пример 2. 0,7 г желатина обливают 4 мл дистиллированной воды для набухания. Затем туда же добавляют 5 мл 0 05 M фосфатного буфера, рН 7,4 и нагревают при перемешивании до полного растворения желатина. Дао лее раствор охлаждают до +20 С и вносят в него при перемешивании 1 г гомогената митохондрий печени свиньи в О, 07 М фосфатном буфере, рН 7, 4.

К полученной суспензии добавляют 1 мл раствора террилитина в воде с активностью 100 ПЕ, т.е. 10 ПЕ/1 мл. Немедленно из полученной смеси 5 мл выливают на алюминиевую фольгу, 5 мл— на кафель, на котором натянута капроновая сетка, и сушат в потоке воздуха в течение 2 ч. Сухую пленку в обоих случаях обрабатывают 5 мл 87.-ного раствора ГА в течение 5 мин. После этого избыток раствора ГА сливают, а пленки многократно промывают водой и 0,05 M фосфатным буфером, рН 7,5.

Капроновую сетку с желатиновой пленкой осторожно снимают с поверхности кафеля. Обе пленки высушивают в потоке воздуха при +25 С в течение 1 ч.

МАО активность диагностического препарата:

6,85 ° 10 Е/мг белка (по тирамину);

5,50 1О Е/мг белка (по серото-0 нину);

4,52 10 Е/мг белка (по бензипамину) .

Бактериостатическая активность.

Задержка роста культуры кишечной палочки в пробах с пленкой диагностического препарата по сравнению с контролем без пленки 86,07 Препарат стабилен в 50 циклах работы.

П риме р 3. 0,5 гжелатина обливают 4 мп дистиллированной воды для набухания. Затем туда же добавляют 5 мл 0,05 М фосфатного буфера. рН 7,4 и нагревают при перемешивании до полного растворения желатина. Дао лее раствор охлаждают до +20 С и вносят в него при перемешивании 2 г ro1495378 могената митохондрий печени крысы (40 мг белка) в 0,07 M фосфатном буфере, рН 7,4. К полученному раствору добавляют 1 мл раствора террилитина в воде с суммарной активностью 50 ПЕ, т.е. 5 ПЕ/1 мл. Смесь перемешивают и по 5 мл выливают на полимерную мембрану и капроновую сетку, натянутую на кафель, и высушивают в потоке о воздуха при 20 С в течение 1 ч. Сухую пленку обрабатывают 5 мл 8%-ного раствора ГА в течение 4 мин. После этого избыток ГА сливают, а пленку многократно промывают водой и 0,05 М фосфатным буфером, рН 7,5. Капроновую сетку с желатиновой пленкой снимают с поверхности кафеля. Пленки о высушивают в потоке воздуха при +25 С в течение 1 ч.

МА0 активность полученного диагностического препарата:

6,76 ° 10 Е/мг белка (по тирамину);

-4

5,62 ° 10 Е/мг белка (по серотонину);

4,71 ° 10 Е/мг белка (по бензиламину)

Бактериостатическая активность.

Задержка роста культуры кишечной палочки в пробах с пленкой диагностического препарата по сравнению с контролем без пленки 85,9 .

Препарат стабилен в 50 циклах работы. !

Прим е р 4. 0,8гжелатина обливают 9 мл воды для набухания.

Затем добавляют 10 мл фосфатного буфера с рН 7,4 и нагревают при перемешивании до растворения. Далее расто вор охлаждают до +20 С и вносят в него при перемешивании 2 r суспензии митохондрий в фосфатном буфере, рН 7,4. К полученному раствору до-. бавляют 1 мл раствора террилитина в воде с суммарной концентрацией 10 ПЕ, т.е. 0,5 ПЕ/1 мл. Смесь перемешивают, и выливают на полимерной мембране.

Высушивают в потоке воздуха в течение

1 ч . Сухую пленку обрабатывают раствором ГА в течение 2 мин и промывают аналогично примеру 3.

NA0 активность диагностического препарата.

4,55 ° 10 Е/мг белка (по тирамину);

3,7 10 F./ìã белка (по серотонину);

3, 1 ° 10 F./èã белка (по бензиламину) °

Бактериостатическая RKòèâíoñòü.

Задержка роста культуры в пробах с пленкой по сравнению с контролем

74,2,. . Препарат пригоден для 20 циклов работы.

Пример 5. !,6 г желатина обливают 15,6 мл воды для набухания.

Затем добавляют 20 мл 0,05 М фосфатного буфера, рН 7,4 и нагревают при перемешивании до растворения. Далее о раствор охлаждают до +20 С и вносят в него при перемешивании 4 г суспензии митохондрий в фосфатном буфере, рН 7,4. К полученному раствору добавляют 4,4 мл раствора террилитина в воде с суммарной протеолитической активностью, равной 440 единиц, т. е °

2р 11 ПЕ/1 мл. Смесь перемешивают и выливают на нерастворимую подложку.

Высушивают в потоке воздуха в течение 1 ч. Сухую пленку обрабатывают

8 -ным раствором ГА в течение 6 мин

25 и промывают.

NA0 активность диагностического препарата:

4,50 10 Е/мг белка (по тирамину);

3,72 ° 10 Е/мг белка (по серото-4

3,2 10 Е/мг белка (по бензиламинУ) .

Бактериостатическая активность.

Задержка роста культуры в пробах с пленкой по сравнению с контролем

Пленка имеет жесткую структуру, что проявляется как повышенная хрупкость, Препарат расслаивается после

40 18-20 циклов работы.

Пример 6. 0,2 гжелатина помещают в пробирку с 2 мл дистиллированной воды для набухания. Затем туда же добавляют 1 мл стандартного

45 фосфатного буфера, рН 6,86, нагрева. ют, перемешивая до кипения, при котором происходит полное растворение желатина. Далее раствор охлаждают о до +35 С и вносят в него при переме50 шивании 0,4 мл гомогената митохондрий печени крыс (таких же, как в примере 3). Добавляют 1,6 мл раствора террилитина с активностью 50 ПЕ, Затем в пробирку со смесью опускают

55 чувствительную головку электрода, слегка подсушивают (1 мин) его в о струе воздуха при +?О С в снова опускают в раствор. Операцию повторяют

5 раз, после чего высушивают пленку

1495378 на поверхности электрода в струе воздуха в течение 15 мин при +20 С. Далее электрод с сухой пленкой опускают на 4 мин в 5 -ный раствор глутарового альдегида. Затем вынимают электрод и тщательно промывают его водой и фосфатным буфером. Йоверхность электрода с планкой высушивают в о струе воздуха при +20 С в течение

15 мин и хранят в холодипьнике при

4-10 С. Для градуировки и в период работы электрод вымачивают в фосфатном буфере при рН 7,4 и хранят в нем в холодильнике.

MAO активность электрода:

6,7 10 Е/мг белка (по триамину);

5,45 10 Е/мг белка (по серото— 4 нину);

4,0, 10 Е/мг белка (но бензил1 амину).

MAO активность электрода сохраняется в течение года. Желатиновая пленка на электроде механически стабильна в условиях использования и может применяться для определения моноаминов в течение года. Предел обнаружения 4,55 10 моль/л.

Бактериостатическая характеристика пленки на электроде аналогична примерам 1, 2, 3.

MAO активность диагностического препарата в Е/мг, т.е. ц моль/мг белка по всем субстратам определяют электрохимическим методом с помощью электрода с газовым затвором по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции — аммиака. !

Бактериостатическую активность определяют и рассчитывают по задержке роста культуры кишечной палочки. в присутствии желатиновых пленок без добавок, с. добавкой МАО и с добавкой

МАО и террилитина. Для этих проб по сравнению с контролем задержка составляет соответственно 57, 75 и 86 .

Предел обнаружения моноаминов с помощью полученных препаратов МАО составляет 4,4 10 — 4, 55 ° 10 М.

Значительно возрастает активность целевого продукта по всем субстратам за счет добавления террилитина при иммобилизации (табл. 1) . Улучшаются также механические свойства пленок, что поз в оля ет длител ьно и с пол ьз ов ат ь их для проведения анализа.

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет получить препараты пленок для определения мо-. ноаминов с улучшенными характеристиками за .счет повышения активности

MAO в 1,5 раза, увеличения механической прочности пленок и их антимикробного действия (от 75 до 86 ).

20@ормулаизобретения

1. Способ получения препарата для определения моноаминов на основе. иммобилизованной моноаминооксидазы, включающий введение гомогената мито25 хондрий, обладаюцих активностью моноаминооксидазы, в водный раствор желатина„ получение желатиновой пленки путем высушивания нанесенного на нерастворимую подложку раствора желати30 на и обработку полученной пленки глутаровым альдегидом, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью улучшения характеристик препарата за счет повышения активности моноаминооксидазы, механической прочности и антимикробных свойств пленки, после введения гомогената митохондрий в водный раствор желатина к полученной суспензии добавляют террилитин в ко40 личестве 1-10 протеолитических единиц на 1 мл обьема и полученную смесь немедленно наносят на нерастворимую подложку.

2. Способ по п. 1, о т ли чав

45 ю щ н и с я тем, что обработку пленки глутаровым альдегидом ведут в течение 3-5 мин.

1495378

Таблица 1

Образец смоль/мг условные ед./г белк а препарата по тирамину по серотонину

3,7 10 3,1 10

4,55 ° 10

1600

5,6 1Ь 4,6 10

6,8 ° 10

2400

Т а блица 2

Образец ачаль- 5 IO ный

20 30

50

Препарат с MAO активностью (без террилитина) 7,3 7,3 7, 1 5,6 Пленка расслаиваетт ся

7,5 7,5 7,5 7,5 7,2

12,0 12,0 12,0 12,0 )1,7

6,9

11,3

6,8

11,3

Составитель В. Муронец Редактор Н. Гунько Техред А.Кравчук Корректор О. Кравцова

Заказ 4217/26 Тираж 500 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãoðîä, ул. Гагарина,101

Препарат с MAO активностью (без террилитина)

Предлагаемый диагностический препарат с МАО активностью (содержаций террилитин) Предлагаемый диагностический препарат с MAO активностью: образец 1 образец 2

Активность, смоль/мг Активность по бензиламину белка ес воздушносухого препарата, мг после количества циклов