Способ идентификации d-рибулозо-1,5-дифосфаткарбоксилазы

Способ идентификации d-рибулозо-1,5-дифосфаткарбоксилазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к биохимии растений, а именно к способам идентификации ферментов в геле после электрофореза, и может быть использовано также в генетике и селекции растений. Цель изобретения - упрощение и ускорение процесса. Для осуществления способа экстракт легкорастворимых растительных белковых с сохранением естественного соотношения концентраций белковых компонентов подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле с последующим окрашиванием геля водным нейтральным раствором феназинметасульфата с концентрацией 0,15-0,35 мас.% до появления в геле зон розового цвета в местах локализации идентифицируемого фермента.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (5D 4 С 12 Q 1/00

3ЩзюзЮ

ПЦЕН1ИО - 1 ьм ЧЕСКАА

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4293009/31 13 (22) 03.08.87 (46) 30.07.89. Бюл. Р 28 (71) Институт биологии Карельского филиала АН СССР (72) А.А.Филимонов (53) 577.15.07(088.8) (56) Гааль Э., Медьеши Г., Варец. кеи Л, Электрофорез в разделении биологических макромолекул. M. . Мир, 1986, разд. II, с.266.

Dean С., Leech К.М. Genome Expres-:

sion During Normal Leaf Development. — Plant Physiol, 1982, v.á9, 9 2, с.904-910. (54) СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ Э-РИБУЛО30-1,5-ДИФОСФАТКАРБОКСИЛАЗЫ

Изобретение относитСя к биохимии растений, а именно к сйособам идентификации ферментов в геле после электрофореза, и может быть использовано также в генетике и селекции растений.

Цель изобретения — упрощение и ускорение процесса.

Способ осуществляют следующим образом.

Навеску листьев исследуемых растений (например, огурца или пшеницы) растирают с небольшим объемом буферного раствора, фильтруют и центрифугируют, получая экстракт легкорастворимых белков, которые затем подвергают электрофоретическому фракционированию в геле. После фракционирования гель извлекают из

„„SU„„1497217 А 1

2 (57) Изобретение относится к биохимии растений, а именно к способам идентификации ферментов в геле после электрофореза, и может быть использовано также в генетике и селекции растений. Цель изобретения — упрощение и ускорение процесса. Для осуществления способа экстракт легкорастворимых растительных белков с сохранением естественного соотношения концентраций белковых компонентов подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле с последующим окрашиванием геля водным нейтральным раствором феназинметасульфата с концентрацией 0,15-0,35 мас.7. до появления в геле зон розового цвета в местах, локализациИ идентифицируемого фермента. трубки и заливают окрашивающим водным нейтральным раствором феназинметасульфата с.концентрацией 0,15

0,35 мас.X.

Пример 1. Навеску листьев огурца измельчают в равном (1 г

1 мл) объеме трис-глицинового буфера (рН 8,3), фильтруют и центрифугируют. В дальнейшей работе используют надосадочную жидкость. Фракционирование полученной белковой смеси проводят в трубках с полиакриламндным гелем (100x8 мм). Состав геля,X: акриламид 7,5; метиленбисакриламид

0,2. Гель полимеризуют при комнатной температуре, добавив 5,75 мкл ТЕМЕД, и 5 мл 0,14Х-ного раствора персульфата аммония на каждые 10 мл гелевого раствора, Белковый экстракт нано1497217

Формула изобр етения

Способ идентификации D-рибулозо-1,5-дифосфаткарбоксилазы, включающий получение экстракта легкорастворимых растительных белков с сохра30

Составитель А.Семенов

Редактор H.Киштулинец Техред М.Ходанич Корректор M.Èàêñèìèøèíåö

Заказ 440б/29 Тираж 501 Подписние

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина, 101 сят на гель в количестве 100 мкл и сверху наслаивают трис — глициновый буфер (рН 8,3) . Предэлектрофорез проводят при силе тока мА на каждую 5, трубку в течение 30 мпн,затем силу тока увеличивают в 2 раза. Продолжительность фракционирования 2,5 ч.

После электрофореза гели извлекают из трубок, однократно споласкива- l0 ют дистиллированной водой и окрашивают в водном растворе феназинметасульфата (ФМС) с концентрацией 0,25% для идентификации РДФК/О. После

30 мин инкубации геля в окрашиваю- 15 щем растворе на бледно-желтом фоне геля четко проявляется ярко-розовая подоса, в месте локализации РДФК/0.

Ц р и и е р 2. Способ осущест- 20 вляют согласно примеру 1,за исклю-. чением того, что для окрашивания используют водные нейтральные растворы феназинметасульфата с концентрациями О 10; О 15; О 25; О 35 и 25

0,40 мас.%. Визуальный анализ результатов окрашивания показывает следующее. Оптимальной для окрашивания гелей является концентрация водного раствора ФМС 0,15-0,35 мас.%, при которой высокая интенсивность (яркость) розовых полос в местах локализации РДФК/О сочетается с высокои скоростью их проявления и слабой фоновой окраской геля.

Уменьшение концентрации ФМС до

0,10 мас.% сопровождается увеличением продолжительности окрашивания и снижением интенсивности полос

РДФК/О, что существенно затрудняет визуальное обнаружение (идентификацию) фермента.

Увеличение концентрации ФМС выше

0 35 мас.% несмотря на высокую скорость процесса окрашивания приводит к сильному потемнению остальной части геля, что также препятствует идентификации РДФК/О (снижается избирательность реакции) . нением естественного соотношения концентраций белковых компонентов, электрофоретическое разделение их смеси в геле с последующим окрашиванием геля в водном растворе красителя до появления цветных зон в местах локализации идентифицируемого фермента, отличающийся тем, что, с целью упрощения и ускорения процесса, в качестве красителя используют водный нейтральный раствор феназинметосульфата с концентрацией

0,15-0,35 мас.%,а процесс окрашивания проводят до появления в геле зон розового цвета в местах локализации D ðèáóëîçî-1,5-дифосфаткарбоксилазы.