Способ определения дефекта антигеннезависимой дифференцировки в-лимфоцитов

Способ определения дефекта антигеннезависимой дифференцировки в-лимфоцитов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии и может быть использовано для определения иммунного статуса организма. Целью изобретения является повышение точности за счет выявления предшественников В-лимфацитов. Для этого лимфациты периферической крови обследуемого инкубируют с пептидами из сумки Фабрициуса в концентрации 2-100 мкг/мл в течение 1-8 ч. Затем осуществляют реакция розеткообразования с эритроцитами, нагруженными антииммуноглобулинами. Антииммуноглобулины против иммуноглобулинов человека "пришивают" с помощью хлористого хрома. Оценку нарушения антиген независимой дифференцировки В-лимфоцитов осуществляют по увеличению лимфоцитов с иммуноглобулиновыми рецепторами после инкубации с пептидами из сумки Фабрициуса по сравнению с контрольной пробой, в которой лимфоциты инкубируют в среде 199 без биологически активных соединений из сумки Фабрициуса. Увеличение числа таких лимфоцитов более 28,3% свидетельствует о нарушении иммунологического статуса. Предлагаемым способом выявлено нарушений у 90,5% больных в сравнении с 38,1% по способу-прототипу.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИжСКИХ

РЕСПУБЛИК (51 )4 G 01 И 33/53

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Е

QCYQAPCTBEHHblA НОМИтКТ

AO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4278867/28-14 (22) 06,07.87 (46) 30.07.89.Бюл. Ф 28 (71) Читинский государственный медицинский институт (72) А.В.Степанов и Б.И.Кузник (53) 615.375 (088.8) (56) Новиков Д.И,, Новикова В,И.

Клеточные методы иммунодиагностики.

Минск, 1979, с. 60-61

f (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЕФЕКТА АНТИГЕННЕЗАВИСИМОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ВЛИМФОЦИТОВ (57) Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии и можеч быть использовано для определения иммунного статуса организма. Целью изобретения является повышение точности за счет выявления нредшественников В-лимфоцитов, Для этого лимфоциты периферической крови обследуео мого инкубируют с пептидами из сумИзобретение относится к медицине, а именно к иммунологии и может быть использовано для определения иммунологического состояния организма.

Цель изобретения — овышение точности оценки дефекта антигеннезависимой дифференцировки В-лимфоцитов, Указанная пель достигается тем, что перед проведением реакции эозеткообразования с эритроцитами,нагруженными антииммуноглобулинами,лимфоциты инкубируют в течение 1-8 ч в присутствии пептидов иэ сумки Фабри циуса (2,0-100 мкг/мл), а оценку

2 ки Фабрнциуса н концентрации 2 .100 мкг/мл в течение 1-8 ч . Чатем осуществляют реакцию розеткообразавания с эритроцитами, нагруженными антииммуноглобулинами. Антииммуноглобулины против иммуноглобулинон человека "пришивают" с помощью хлористого хрома. Оценку нарушения антигеннезанисимой дифференцировки В-лимфоцитон осуществляют по увеличению лимфоцитов с иммуноглобулиновыми рецепторами после инкубации с пептидами из сумки Фабрициуса по сравнению с контрольной пробой, в которой лимфоциты инкубируют в среде 199 без биологически активных соединений из сумки Фабрициуса. Увеличение числа таких лимфоцитон более 28,3Х свидетельствует о нарушении иммунологического статуса. Предлагаемым способом выявлено нарушений у 90,5% больных в сравнении с 38,1% по способу-прототипу. осуществляют по увеличению количества лимфоцитов с иммуноглобулиновыми рецепторами после.инкубации. Так,при увеличении числа лимфоцитов с иммуноглобулиновыми рецепторами более

28,3Х диагностируют дефект антигеннезависимой дифференцировки В-лимфоцитов.

Способ осуществляется следующим образом.

О с

Для приготовления тест-зритроцитов используют поливалентную антисыворотку против всех иммуноглобулиион человека. Белковый преципитат из ан3 .1 497

Фисыворотки, полученный высаливанием с, помощью 33%-ного раствора сульфата аммония, растворяют в дистиллированной воде и диализуют против 0,0175 М

Фосфатного буфера, рН 6,3. Концентрацию белка определяют на спектроФотометре СФ-16 при дпине волны

280 нм. К 0,2 мл 50%-ной суспенэии

Зритроцитов барана, отмытых три раза ! иэиологическим раствором, добавлят при комнатной температуре равный бъем у-глобулиновой фракции (содер. ание белка 3-5, Mr/мл) ° К постоянно еремешиваемой взвеси добавляют

,1 мл раствора хлористого хрома (0,25-0,01 мг/мл). После инкубафии в течение 5 минут клетки трижды отмывают забуфереиным физиологичесфим раствором (рН 7,3) и из них готовят 0,5 %-ную суспенэию, Приготовлен-. ные таким образом тест-эритроциты ранят при 4 С в течение 1 недели. !!еред использованием после хранения тест-эритроциты отмывают однократно средой 199 или физиологическим раствором, Выделение лимфоцитов проводят

Стандартным образом.

Кровь больного собирают в пробирКи, куда предварительно был внесЕн.

1 епарин (25 ед/мп крови). Затем

Кровь разводят в соотношении 1:3

Изотоническим буферным раствором, наслаивают на смесь фикол-гипак плот, остью 1,077 г/мл и центрифугируют течение 30-40 минут при 400р.Соби рают слой клетрк с интерфазного слоя и 3 раза отмывают средой 199, В суспензии отмытых лимфоцитов опре-, деляют количество клеток и доводят до концентрации 2-4х10 клеток на

4 о

1 мл. Далее s 2 конические пробирки вносят по 0,1 мл взвеси лимфоцитов и затем в первую пробирку добавляют

0,1 мл среды 199, а во вторую 0,1 мл среды 199 с пептидами из сумки Фабрициуса в концентрации 4-200 мкг/мл.

Обе пробирки помещают в термостат и инкубируют при 37 С в течение 1

8 ч. Затем пробы один раз отмывают центрифугированием при 200@ в течение 5 мин физиологическим раствором и.взвешивают осадки клеток в объеме

0,1 мл Физиологического раствора.

Определяют в тесте с трипановым синим жизнеспособность клеток, которая должна быть не менее 95-97 X. В обе пробирки вносят эритроциты, сенсиби.

574 4 лизированные антииммуноглобулинами, объемом 0,1 мл 0,5 X-.íîé взвеси. В эти же пробирки вносят по О,1 мл

0,05 %-ного раствора аэида натрия для блокады связыВания лимфоцитами эритроцитов, обработанных иммуноглобулинами эа счет F- -рецепторов.

Смесь клеток инкубируют при 37 С в течение 15 мин, затем центрифугируют 5 мин при 500 об/мин и инкубируют 8-16 ч при 4 С, Затем осадок ресуспендируют осторожным встряхиванием и подсчитывают число розеткообразующих клеток (% POK). Просчитывают не менее 200 лимфоцитов. За РОК принимают лимфоциты, присоединившие

3 и более тест-эритроцитов, Увеличение числа POK после инкубации опре20 .деляют по формуле:

А-В

С

В где С вЂ” Х увеличения числа розетко-, 25 образующих клеток после инг кубации с пептидами из сумки Фабрициуса;

А — число POK во второй пробирке;

 — число POK в первой пробирке. о

Для определения режимов инкубации используют кровь от больных с выраженными иммунодефицитами. Из крови в стандартных условиях способа получают лимфоциты, которые инкубируют в течение 5,20,60,120,240,480, 600 мин с пептидами из сумки Фабрициуса (концентрация 10 мкг/мл), Затем смешивают отмытые лимфоциты с тест-эритроцитами и определяют число POK.

Зависимость процесса розеткообразовання лимфоцитов с эритроцитами, нагруженными антииммуноглобулинами, от времени инкубации представлена в табл. l..

Контроль — это лимфоциты, инкубированные в среде 199 в течение

60 мин, такое время необходимо для того, чтобы адсорбированные цитофильные иммуноглобулины покинули лимфоциты и остались только истинные мембранные иммуноглобулины, которые синтезированы данной клеткой. При дальнейшей инкубацни (более 60 мин) число лимфоцитов не возрастает.

Данные табл,1 показывают, что наиболее выраженный и достоверный эф497574

2.

50

5 1 фект увеличения лимфоцитов с иммуыоглобулиновыми рецепторами наблюдают, если суспензию лимфоцитов инкубируют с пептидами из сумки Фабрициуса в течение 60-480 мин (1-8 ч). Если инкубация продолжается менее 1 ч или более Я ч, то увеличение лимфоци тов с иммуноглобулиновыми рецепторами недостоверно.

Зависимость влияния концентрации пептидов иэ сумки Фабрициуса в инкубационной среде представлена в табл.

Лимфоциты получают и готовят тест эритроциты в стандартных условиях способа.

Данные табл.2 показывают, что наиболее выраженный эффект на розеткообразование оказывают пептиды из сумки Фабрициуса в концентрации

2,0-100,0 мкг/мл среды 199. При других концентрациях пептидов наблюдаются недостоверные показатели.

Таким образом, только инкубацией лимфоцитов с пептидами из сумки Фабрициуса в концентрации 2,0

100,0 мкг/мл в течение 1-8 ч обеспечивается наиболее оптимальное влияние на рецепторный аппарат В-лимфоцитов: иммуноглобулиновые рецепторы, Был проведен сравнительный анализ группы здоровых доноров (25 человек) и группы больных (21 человек).

При осуществлении предлагаемого способа. было установлено, что у здоровых людей после инкубации лимфоцитов с пептидами из сумки Фабрициуса увеличивается количество розеток с эритроцитами, нагруженными антииммуноглобулинами на 12,3 1,3 Х (М+м), а у больных — на 44,8+7,5 (Мйм).

При сравнении результатов достоверность различий в данных группах составила Р (0,01, что свидетельствует о том, что в группе больных по сравнению со здоровыми людьми выявляется большее количество незрелых форм

В-клеток.

Данные по апробации способа на больных с ожогами 2-3 степени (ll больных), отморожениями. 2-4 степени (5 больных), гнойным перитонитом (4 больных), абсцессом дугласова пространства (1 больной) представлены в табл.3, Данные табл.3 показывают, что известным способом выявляют нарушения иммунного статуса у 38,IX больных (по сравнении с нормальными показателями 20-30Х, прецлагаемым способом — y 90,5Х больных (с учетом того, что у здоровых больных увеличение лимфоцитов с иммуноглобулиновыми рецепторами происходит до

20Х).

Предлагаемый способ позволил выявить дополнительную группу больных (52,4X) с нарушениями иммунологического статуса, а также установить причину этих нарушений, связанную с тем,что нарушается антиген независимая дифференцировка В-лимфоцитов.

Это позволило в дальнейшем назначить коррегирующее эти сдвиги лечение.

Таким образом,применение предлагаемого способа позволяет повысить эффективность контроля иммунологического статуса больного в сравнении с известным способом на 52,4Х.Применение предлагаемого способа позволяет оценить состояние дифференцировки В-лимфоцитов не по абсолютной величине ПАРР в суспензии лимфоцитов периферической крови, а по характеру приращения, исключив иэ рассмотрения фоновую составляющую ПАРР.

Пример 1. Больной M.,29 лет.

Диагноз: ожог II-III степени 24Х поверхности тела. Способом-прототипом установлено количество лимфоцитов с иммуноглобулиновыми рецепторами 22Х, т.е. в пределах нормы. После инкубации с пептидами иэ сумки Фабрициуса в стандартных условиях способа процент POK повысился до 38Х. Увеличение количества лимфоцитов с иммуноглобулиновыми рецепторами произошло на 72,7Х, что свидетельствует о нарушении в иммунологическом статусе, а именно о нарушении антигеннеэависимой дифференцировки В-лимфоцитов.

Пример 2, Больной В., 39 лет.

Диагноз: разлитой гнойный перитонит.

Способом прототипом установлено, что количество В-лимфоцитов равно

20Х т.е. в пределах нормы. После инкубации лимфоцитов с пептидами из сумки Фабрициуса процент POK повысился до 34 Х. Увеличение количества лимфоцитов с иммуноглобулиновыми рецепторами произошло на 70Х, что свидетельствует о большом содержанйи предшественников B-клеток и о нарушении дифференцировки В-лимфоцитов.В

1497574 реальнейшем была осуществлена коррекция этих нарушений.

Формула изобретения

Способ определения дефекта антигеннезависимой дифференцировки B лимфоцитов путем добавления к лимфоци ам периферической крови больного ест-эритроцитов, нагруженных антимуноглобулинами, с последующим подТ а блица 1

Показатели Контроль

Лимфоциты, инкубированные с пептидами из сумки

Фабрициуса, в течение мин

5 20 60 120 240 480 600

21,1

2,04

26,7

1,37

26,5

1,08 достоверные величины по отношению к контролю.

Таблица 2

Лимфоциты, инкубированные с пептидами из сумки Фабрициуса, при концентрации мкг

Показатели Контроль (среда

199) Оэ1 0э,5 2э0 10э0 100в0 500эО

21,5 229 26 7 30,9+ 329 30 5 247

2,04 2,04 1,08 1,37 2,43 1,69 2,04 достоверные результаты по сравнению с контролем, Лимфоциты с новерхност-! ными иммуноглобулинамиь

n=10 M

Лимфоциты с поверхностными иммуноглобулинаЖ

И

n=l 0

M счетом розеткообразующих лимфоцитов, отличающийсятем,что, с целью повышения точности способа, 5 перед добавлением тест-эритроцитов лимфоциты инкубируют в ечение 1-8 ч в присутствии 2-100 мкг/мл пептидов из сумки Фабрициуса и при значении количества розеткообразующих лимфоцитов свыше 23,8Х определяют нарушение антигеннезависимой дифференцировки

В-лимфоцитов.

Ф

31,1 32,4» 33,6 32,5» 27,6

1,08 1,69 2,04 1,08 1,37

1497574

Т а б л и ц а 3

Лимфоциты после инкубации

Показатели в среде 199 (прототип) с пептидами из сумки

Фабрициуса

22,,1+1,5 32,0+1,98

16-153

38,1

90,5

Составитель Н,Калинин

Техред Л. Олийнык

Корректор М.Максимишинец

Редактор Л.Пчолинская

Заказ 4439/47 Тираж 789 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

1130359 Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,101

Р0К с эритроцитами,нагруженными антииммуноглобулинами, Х

Нарушения иммунологического статуса, Ж

Увеличение числа РОК после инкубации с пептидами из сумки Фабрициуса,Ж