Гидрохлорид 0-[3-(3-карбоксипропиламино)-2-гидроксипропил)] декстрана в качестве анализатора нейрональных рецепторов гамма-аминомасляной кислоты поверхностно-мембранной локализации

Патент 1503272

Авторы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к новому высокомолекулярному соединению, а , именно к азотсодержащему производному декстрана, и может быть исполь-. зовано для научно-исследовательских целей в биологии и медицине. Изобретение позволяет создать анализатор поверхностно-мембранных нейтральных рецепторов гамма-аминомасляной кислоты , не проннкаюпшй через биологические мембраны за счет структуры полученного соедннения - гидрохлорида (3-кapбoкcипpoпилaминo)-2- гидpoкcипpoпил декстрана формулы (Л -OCHi п юо-к -С-СНг №° НО V J х Г НС1 HOCHCHjNHCHiCHjCHiCOOH СП где 1 2,3 - 13,7, 4 табл. со Ю

COtO3 СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

\Ф

° °

Н .3

9 х

НС!

НОСНСИ ЮНСН СН) СН)СООН

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГНКТ СССР (46) 15,01. 91. Бил. Я - 2 (21) 4089713/05 (22) 08. 07. 86 (71) Научно-исследовательский институт фармакологии АМН СССР (72) Е .А.Кузнецова, Г.И.Ковалев, А.В.Прихожан и К.С.Раевский (53) 547.458.68(088.8) (56) De Feudis F.×. et al. GABA

and museimol binding ргосеввеа in

CNS tissue culture preparations.

"Adv. Biochem. РвусЬорЬагшасо1., v. 29, 1981, рр. 405-406.

Raiteri М. et al. А simple apparatus for studying the release of .neurotransmitters from synaptosomes.

"Fur. j. Pharmacol,", v. 25, 1974, рр. 411-414.

Watkins I.С. et al. Excitatery

amino acids transmitters. "Ann. Rev.

Pharmacol. Toxicol", ч. 21, 1981, рр. 165-204.

Davies Ь.P. et al. Uptake and

release of D-and L-Aspartate by rat

brain alices. "I. Neurochem", v. 26,,1976, рр. 1007-1014. (54).ГИДРОХЛОРИД О-(3-(3-КАРБОКСИПРОПИЛАМИНО)-2-ГИПРОКСИПРОПИЙ ДЕКСТИзобретение относится к новому высокомолекулярному соединению, а именно к азотсодержащему производному декстрана, которое может быть использовано для научно-исследователь" ских целей в биологии и медицине.

Целью изобретения является создание анализатора поверхностно-мамбранааас рецепторов гамма-амнномасляной

„„SU„„1503272 А I (51)5 С 08 В 37/02//Г 01 N 33/50

РАНА В КАЧЕСТВЕ АНАЛИЗАТОРА НЕИРОНАЛЬНЫХ РЕЦЕПТОРОВ ГА)ЖА-АМИНОМАСЛЯНОЙ КИСЛОТЫ ПОВЕРХНОСТНО-МЕМБРАННОЙ

ЛОКАЛИЗАЦИИ (57) Изобретение относится к новому высокомолекулярному соединению, а именно к аэотсодержащему производному декстрана, и может быть исполь-. зовано для научно-исследовательских целей в биологии и медицине, Изобретение позволяет создать анализатор поверхностно-мембранных нейтральных рецепторов гамма-амнномасляной кис" лоты, не проникающий через биологические мембраны за счет структуры полученного соединения - гидрохлорн- ф да О- f3-(3-карбоксипропиламино)-2гидроксипропил1 декстрана формулы где )" 2,3 - 13,7, 4 табл. кислоты (ГАИК), не проникающего че" рез биологические мембраны.

Изобретение иллюстрируется следующими прнмерами.

:Пример I. Раствор 0,25 г (0,1 М-экв. бромгидринных групп)

0-(3-бром-2-гидроксипропил)декстрана с мол, м. 71 2 тыс. в 10 мл води) подщелачивают ) í, NaOP. до рН )), 1503272

ГАМК на 100 ангидроглюкоэных звеньев (P 2,3). Выход 9,1Х.

Найдено, Х: N 0,20, 0,21;

Сl 0,38, 0,33. (С6Н43 ) 97, 7 (С, Н, 100е ) 2, 3 а

Вычислено, Х: И 0,19; С1 0,49.

Полученные по примерам 1-3 поли". мерные производные очищают 1 иализом

10 и многократным переосаждением спиртом нэ водного раствора под контролем ТСХ: до отсутствия примеси низ, комолекулярной ГАМК, Хроматографию проводили на пластинках "Силуфол" в системе: этилацетат-муравьиная кис-, лота-вода (7:2:1). Низкомолекуляр ная ГАМК имеет Rf 0,42, полимерная I AMK остается на старте (проявление пятен нингидрином).

Степень замещения в приведенных примерах рассчитывают по формуле

162 100 XN

Nn- ХНМ

25 где N и

Найдено, Х: N 0,72, 0,63;

С1 1 ° 21э 1 ° 09 ° (C H„P ) ° 91,5 (C, Ü $1NOâ) 8,5., 40

Вычислено, Х: N 0,66; Cl 1,69..

Пример 3. Раствор 0,25 r (0,1 M-экв бромгидринных групп)

0-(3-бром-2-гидроксипропил)дексатра на в 10 мл воды подщелачивают 1 и, 45 раствором NaOH до рН 1 l. Через 15 мий доводят раствор до рН 9,005 М раст вором тетрабората натрия. Затеи прибавляют раствор 0,5 г (5 ммоль)

ГАИК в 5 мл боратного буфера. Перемешивают при 45+5 C в течение 2 ч.

Смесь подкисляют 1 и. раствором HCl до рН 5 и диалиэуют против подкис ленной воды. Диализат концентрируют в вакууме прн 40 С и полимер очищают многократным переосаждением спир том из водного раствора. Получают

0,05 г полимера. Содержание ГАМК в полимере 1,3 мас.Х или 2,3 остатка через 15 мин доводят рН раствора до

10 с помощью 20 мл 0,05 М раствора тетрабората натрия и I í. NaOH u добавляют 0,5 r (5 ммоль) ГАМК в

5 мл боратного буфера. Перемешивают при 40-50 С в течение 5 сут. при рН 10,5. Смесь подкисляют 1 í. НС1 до рН 5 и дналиэуют против воды с тем же рН. Диалиэат концентрируют и полимер многократно переосаживают спиртом иэ водного раствора. Получают 0,14 г полимера с мол. м.

77+3 тыс. Выход 25,4X. 13,7.

ИК-спектра,, см (KBr) : 1565, 1400 (симметричные и асимметричные колебания иона СОО ).

Найдено, Х: М 1,14 1,11;

С1 2,00, 1,76. (c6H„,O ) 86,3 (С„Н,Я1КО ) 13,7.

Вычислено, Х: N 1,08; Сl 2,05.

Пример 2. Аналогично примеру 1,1 r 0,4 М-экв. бромгидринных групп О-(3-бром-2-гидроксипропил) декстрана в 20 мл воды активируют

1 н. NaOH доведением до рН 11 и выдерживанием при этом рН в течение

15 мин, добавляют 20 мг 0,05 М раствора тетрабората натрия, доводят до рН 9,5, прибавляют 0,41 г (4 ммоль)

AMK и перемешивают при 45-50 С и рН 9,5 в течение 6 ч, Обрабатывают, как в примере 1. Содержание ГАМК в полимере 4,7 мас.X или 8,5 остатков

ГАМК на 100 ангидроглюкоэных звеньев (g 8,5). Выход 0,25 r (12,2X).. мол.м.„ атома азота; вЂ” число атомов азота; вЂ” масса чистой привески saмещающей группы;

XN - данные-анализа на азот, Изучение механизма действия предлагаемого соединения в качестве ана-, лизатора рецепторов ГАМК проводили на моделях пресинаптических и постсинаптических рецепторов ГАМК.

Модель пресинаптических рецепторов ГАМК.

Пресинаптические рецепторы изучали на примере рецепторов ГАМК, локалиэированных на нервных окончаниях ГАМК-ергических нейронов, где эти рецепторы регулируют процесс выс.вобождения нейропередатчика из окончания нейрона в синаптическую щель..

Исследование проводили на синаптосомах коры головного мозга крыс по общепринятой методике. Гомогениэированную ткань мозга подвергали двойному центрифугированию в изотоническом растворе саха„,азы. Полученную фракцию синаптосом инкубировали с

Н-ГАМК в Кребс-бикарбонатном буфере при 37 С. Инкубацию прекращали нанесением суспензии сииаптосом на стеклянно-волокнистые фильтры, закрепленные в термостатируемых камерах. Среду инкубацпн удаляли при скорости 4 мл/мин с помопй:ъ перистальтического насоса. Сннаптосомы дважды

5о

55 промывали по 2 мл буфера, затем вносили буфер, содержащий повышенную концентрации ионов калия (30 мМ).

Такой прием является общепринятым способом моделировании деполяризации нервных окончаний, что в живом организме сопровождается высвобождением природных нейропередатчиков, включая ГАМК. На фоне модельной деполяризации добавляли исследуемые вещества. Рабочую перфузию проводили при скорости 2 мл/мин. Изменение высвобождения метки фиксировали по радиоактивности суперфузата, определяемой методом жидкостной сцинтнл- ляционной спектрометрии.

В табл. 1 представлены данные опытов по изучению влияния предлага" емого соединения на стимулируемое высвобождение Н-ГАМК в сравнении с

3 эталонным агонистом рецепторов ГАМК мусцимолом, а также самой I ANK. Вид но, что ГАМК (10"1М) резко усили,вает высвобождение H-ГАМК. Этот эффект не устраняется специфическими антагонистами рецепторов ГЛМК бикукуллином и пикротоксином, что свидетельствует о неадекватности применения самой ГАМК в качестве анализатора рецепторов в данной модельной системе из-эа включения ее в процесс гомообмена с Н-ГАМК, что лишено физиологического значения и является артефактом. Эталонный агокист рецепторов ГАМК мусцимол (10 М) достоверно повьппал высвобождение Н- АМК, и этот эффект устраз нялся как бикукуллином, так и пикротоксином. Аналогичное действие оказывало предлагаемое соединение в эквимолярной концентрации (в рассчете на ГАМК).

Результаты этих экспериментов свидетельствуют о том, что предлагаемое соединение обладает средством, к пресинаптическим рецепторам ГАМК, не уступая эталонному агонисту рецепторов ГАМК, но, в отличие от ниэкомолекулярной ГАМК, не проникает через биологические мембраны нервным клеток, что доказывается отсутствием явления гомообмена, Данный вывод подтвержается опытами по изучению влияния предлагаемого соединения в сравнении с типичными агонистами рецепторов ГАИК с мусцимолом и

SL 75102 на спонтанное высвобождез ние Н-ГАМК. Этот процесс не регулируется рецепторами, а служит индикатором возможного неспецнфического мембранного действия биологи-, чески активных соединений в опытах

in vitro. Методически зти опыты отличались от предыдущих тем, что исследуемые вещества добавляли к синаптосомам в исходном буфере (5 мМ

KCl). Результаты экспериментов представлены в табл. 2, из которой вид- но, что даже в максимальной нз исследуемых концентраций (!О М) предлагаемое соединение не вызывает резкого повышения выхода метки (в отличие от SL 75102 и в меньшей степени мусцимола). Эти данные не только подтверждают отсутствие гомообмена предлагаемого соединения с з

Н-ГАМК, но и его малую мембранотропность, Это позволяет использовать предлагаемое соединение в отно-! сительно больших концентрациях в опытах in vitro без потери при этом. специфичности его рецепторного дей- ствия

Модель постсинаптических рецептор в r K.

Воздействие предлагаемого соединения на постсинаптические рецепторы ГАМК изучали на примере рецепто- . ров ГАМК, локализованных на окончаниях глутаматергических нейронов.

Эти рецепторы регулируют высвобождение глутаминовой кислоты " основногО возбуждающего аминокислотного нейроп ередатчик а. Методика из учения влияния веществ на высвобождение аналогична вышеописанной, за исключением., следующего. Синаптосомы инкубирова3 лись с Н-Д-аспартатом, являющимся субстратом системы высвобождения глутаминовой кислоты. Действие веществ оценивали по их влиянию на

K (30,мМ) вЂ” стимулируемое высвобождение Н-Д-аспарата. Данные по сравнению действия эталонного агониста рецепторов IAMK мусцимола с предлагаемым соединением на этот процесс представлены в табл. 3. Иэ приведен ных данных следует, что предлагаемое соединение значительно превосходит мусцимол (в эквимолярной концентра-; ции) по влиянию на изучаемый про» цесс. Если эффект мусцимола отличает ся от контроля лишь при р (0 1 то ингибирующее действие предлагаемого соединения было высокодостоверйым при р (.0,01. Это действие устраня-, 7 - 1503272в

-0-СН но(30

Таблица ) Влияние ГАМК, мусцимола и предлагаемого соединения 1 на

К -стимулируемое высвобождение Н-ГАМК иэ перфуэнруемых

+ 3 синаптосом коры мозга крыс (модель пресинаптических рецепторов ГАМК) Н-ГАИК, ля

Вещество

К (30 мМ) 32

10 . 12

104

)00,0 2,)

230 0 5 8

Контроль, ГАМК;

215,5 7,9 ""

+ бикукуллин, ГАМК

250,0 7,) "а

)30,4 3,3

)О 4

+ пикротоксии

)О

Мусцимол. лось антагонистами рецепторов ГАМК бикукуллииом и микротоксином, что позволяет предположить участие рецепторов ГАИК в реализации эффекта предлагаемого соединения по данному тесту.

Дальнейшее сравнение предлагаемого соединения с эталонным агонистом рецепторов ГАМК мусцимолом по влиянию на постсинаптические рецепторы

ГАМК проводили на модели активации бензодиазопиновых рецепторов. Эти рецепторы сопряжены с рецепторами

ГАИК в едином ГАМК-бенэодиаэопиновом рецепторном комплексе. В качестве агониста бензодиазопиновых рецепторов испольэовали отечественный транквилизатор беиэодиаэопинового рядавЂ” фенаэепам. Как следует из данных, приведенных в табл. 4, фенязепам снижал К -стимулируемое высвобождеФ, ние Н-Д-аспартата. Устранение этого

3 ,эффекта избирательным антагонистом бензодиазопиновых рецепторов соеди нением РО 15-1788 свидетельствует о том, что эффект феназепама реализуется через бенэодиазопиновые ре". цепторы..На фоне действия фенаэепама мусцимол, как и предлагаемое соеди- i . нение, в эквимолярной концентрации. (10 М) вызывали более выраженное ингибирование изучаемого процесса.

Эффекты обоих исследованных веществ устраняются как бикукуллином, так и пироксином (см. табл. 4). Это позволяет предположить, что предлагаемое соединение не уступает эталонно- му агонисту рецепторов ГАИК мусцимо лу по сродству и постсинаптическим рецепторам ГЛИК, которые ассоциированы с бензодиазопиновыми рецепторами.

Таким образом, проведенные иссле дования позволяют сделать вывод о том, что предлагаемое соединение яв-, ляется высокоактивным агонистом син-, аптических рецепторов ГАМК, не уступающим эталонным анализаторам. В от" личие от последних предлагаемое сое" динение представляет собой высокомолекулярное производное декстрана, которое не проникает через клеточные мембраны, что обеспечивает воэможность воздействия лишь на поверх ностные нейрональные рецепторы ГАМК. формула изобретения

Гидрохлорид 0-(3-(3-карбоксипро- ° пиламино) -2-гидрок сипропил) дек страна формулы

НС)

НОСНСН ХНСН)СИ) СН СООН где 2,3-13,7, в качестве анали-.

)5 затора нейрональных рецепторов гамма-аминомасляной кислоты поверхнбст" но-мембранной локализации.

I 503272

Продолхение табл.1

10 4

100 2+3 9

l0 4

lO 4

107,3+2,8

126,6 1,5

10 "

Соединение I

105,010,7

+ бикукуллин, 10 4

Соединение I

+ пикротоксин

110,012, 1 «ь

П p sf м е ч а и и я. вЂ” достоверность отличий от контроля при р <0,05; - отсутствие достоверных отличий от эффекта ГАМК, 10 М при р (0,05; о - достоверность отличий от эффекта мусцимола, 10 4М при р < 0,05;

В вЂ” достоверность отличий от эффекта соединения 1,10 4 М при р < 0,05.

Формула мусцимола:

ОН

ИНИН 2 Я

Таблица. 2

Влияние типичных агонистов рецепторов ГАИК и предлагаемого соединения I на спонтанное высвобождение Н-ГАМК нз перфузируемых синаптосом

Ь коры мозга крыс

l l 100,0+I 2

4 94,0 41,4

10 4

110,0 5,9

10 4

10-6

lp4

Мусцимол.

+ бикукуллин1

Мусцимол

+ пикротоксин

Соединение I - по изобретению, Контроль

Мусцимол

То ке и

SL 75102

То ие

142,0 5,7 «

ll0,013,6

174,0+5,7 «

229,018,4

1 503272

Продолжение табл.2!

О d

Соединение I

То же

1O-

ff р и м е ч а и и.е. + вЂ” достоверность отличий от контроля при р (0,05 SL 75102 имеет формулу

Таблица 3

Влияние мусцимола и предлагаемого соединения I на К -стимулируемое высвобождение Н-Д-аспарз тата из перфузируемых синаптосом коры мозга крыс (модуль постсинаптических рецепторов ГАМК) Вещество

100,012,5

Соединение

Соединение I

95,01.1,2

10-

+ бнкукуллин

Соединение I

10 1

101 5<5,3

+ пикротоксин

П р и м е ч а н н е. - достоверность отличий от контроля при р (0,011 ч - достоверность отличий от эффекта соединения I

lO " M при р (0,05.

Контроль

Иусцимол

Му цимол

Соединение I

97,0 2,8

102,014,1

108,0Н,5 и

F CHNHCH CH CH С00Н

Концент- Число Высвобождение рация, И опытов Н-Д-аснартата, Х от контроля

99 р 7 4 ° 6

93,413, l

103,915,2

36,4 1Л,6

1 503272

Таблица 4

Влияние мусцимола и предлагаемого соединения I на К "стимулируемое высвобождение Н-Д-аспартата из лерфуэируемых синаптосои коры мозга крыс в присутствии феназепама (модель постсинаптического

ГАИК-бензодиаэепннового рецепторного комплекса) I

Высвобождение з

Н-Д-аспартата (в Х от контроля) Концент- Число рация, И опытов

Вещество к (30 ии) 50

104 9

100,0+3,5

87,613,7

Контроль

Феназепаи

Феназепам.

+ R0 15-1788

Фенаэепаи

+ иусцииол

Феназепам

+ иусцииол

+ бикукуллин

Фенаэепаи

+ иусцииол

+ ликротоксин

Феназепаи

Х соединение I

Фенаэелаи

+ соединение I

+ бикукуллин

Фенаэепаи

+ соединение I

+ ликротоксин

) 0-4

l0"

lOOO27 ц

10 4

74,2+),2

)о 4

) 0-5

86,9 3, 1

l 2.

IO 4 в

88,312,2

)04

73,8 3,0

85 7+2 2 tb

83, 3+1,9" в

П р и м е ч а н и е. ->достоверноСть отличий от контроля лри р < 0,05;

4 - достоверность отличий от эффекта фенаэе аиа, )6 И при р< О,О5; - достоверность отличий от эффектов фенаэецама, 10 4 + мус- . цимол, 10 4М;

В- достоверность отличий от эффектов фенаэепама 10 "M + соеВ э динение I, 10 M ври р (0,05.