Способ получения ферритин-специфических антител

Способ получения ферритин-специфических антител

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к медицинскому микроанализу, а именно к иммунорадиометрическому определению ферритина, и может быть использовано в клинической биохимии, биотехнологии и медицине для диагностики ряда заболеваний гематологического и онкологического профилей. Цель - улучшение качества пол чаемьгх ферритин-специ2 фических антител,Поставленная цель достигается способом, включающим инкубацию сыворотки крови иммунизированных кроликов с ферритином, ковалентно связанным с Г)ГСН-активированной сефарозой 4В, отмьшку балластных белков буферными растворами нейтральных рН при варьировании ионной силы (NaCl 0,2-1 М) и с добавлением детергента (0,3%-ный твин-20), элюцию ферритин-специфических антител растворами с кисльми значениями (рН 3 - элюцип антител низкой аффинности, рН 2,3 - элюция высокоаффинных антител) и адсорбционную хроматогрлфюо препарата антител на гранулированном нолиакриламлдном носителе (биогель, акрнлекс позволяющую удалить примесные продукты кислотной деструкции ферритина. В результате достигается уменьшение времени анализа при сохранении показателей его чувствительности, точности и достоверности. С

(!едГ1 е

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

ls»s G 01 N 33/531

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А8ТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (46) 30.12.92 Бюп. !7 40

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И OTHPbfTHRM

ПРИ ГННТ СССР

I (21) 4237847/14 (22) 27.04.87 (71) Институт биорглнической химии

АН БССР (72) С. П. Млрцев, Г. И. Лепешева, А, В. Чейкина, В. И. Влсилевский, Н. В, Ливень и И. П. Вигдорович (5Ü) Cowan S. I. et а1. Intern. Atomic Energy Agency, Vienna, 1979, vo1. 1, р. 347-357. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРР!1ТИН-СПЕЦИФИг! Е СКИ Х АН ТИТЕЛ (57) Изобретение относится к медицинскому микролнализу, а именно к иммунорадиометрическому определению ферритина, и может быть использовано в клинической биохимии, биотехнологии и медицине для диагностики ряда заболеваний гемлтологического и онкологического профилей. Цель - улучшение качества получаемых ферритин-специИзобретение относится к медицинскому 1гикроанализу и может быть испольэовлно в клинической биохимии, биотехнологии и медицине для диагно» стики ряда заболеваний гематолбгического и онкологического профилей.

Целью изобретения является улучшение чистоты целевого продукта.

Способ получения ферритин-специфических антител заключается в том, что препарат феррнтин-специфических антител, получаемый с помощью кислотной элюции с ферритин-сефароэы, очищают

„„SU„„1503508 А 1 фических антител.Поставленная цель дос тиглется способом, включающим инкублцию сыворотки крови иммуниэированиъгх кроликов с ферритином, ковалентно связанным о ВгСЛ-активирован- ной сефлрозой 4В, отмывку балластных белков буферными растворами нейтральных рН при варьировании ионной силы (NaC1 0,2-1 М) и с добавлением детергента (О, ЗХ-ный твин-2г1), элюцию ферритин-специфических антител растворами с кисльии значениями (p1! 3 — элюция антител низкой лффинности, рН 2,3 элюция высокоаффинных антител) и эдсорбционн о хроматографию преплрлта антител на гранулировлнном полилкрил Й амидном носителе (биогель, акрилекс поееоддодую удепить прииетиие продуи- Я ты кислотной деструкции ферритина.

В результате достигается уменьшение времени анализа при сохрлнении показателей его чувствительности, точности и достоверности. вии от продуктов деструкции ферритнна с помощью дополнител ь ной х ром это графин на гранулированном полиакриллмилегом носителе (например, на биогеле P unu акрилексе). уроматогрл<1>ию на полиакриламидном носителе проводят, присыпая расчетное количество сухого гранулированного носителя в рлствор ферритин-специфических лптител, что приводит к быстрому илбухлиии грлнул геля и прочной лдсорбпии иродуKtoB деструкции ферритинл нл матрице полиакриламидного полимера, л то лремя

3 15035 как фсрритин-специФические антитела в данных условиях остаются несвязанными с матрицей полиакриламидного геля. Кроме того, с помощью биогеля удается сконцентрйровать препарат

5 антител в 3-6 раз, что также весьма существенно для их последующего использования в количественном иммунометрическом анализе. 1О

Пример 1. Получение ферритин-специфических антител заявляемым способом.

Для получения аффинного адсорбента ферритина селезенки человека иммо- !5 билизуют на С В-сефароэе 4В стандартным методом, инкубируя С В-сефарозу

4В с ферритином 3 ч при комнатной температуре и рН 8,3. Концентрация иммобнлизованного ферритина составля- 20 ет 7-10 мг/мл уплотненного геля. Сыворотку крови кролика, содержащую антитела к селезеночному ферритину человека, получают путем иммунизации кролика I мл раствора, состоящего из 25 смеси 0,5 мл адьюванта Фрейида и

0,5 мл физиологического раствора, содержащего 100 мкг ферритина из селезенки человека. Инъекции проводят с интервалом в одну неделю 3 раза, за- 30 тем через 3 недели осуществляют четвертую инъекцию и спустя 10 сут начинают отбор крови у животных. Полученную антисыворотку (3 мл) смешивают с ! мл уплотненной ферритин-сефарозы и 35 добавляют 3 мл буфера, содержащеro

0 05М трис-НС1 и 0,2М хлористого натрия, рН 8,0. После перемешивания в течение I, 5 ч при комнатной температуре осадок ферритин-сефароэы отделя- 40 ют центрифугированием при 1500 а в течение 3 мии и промывают последовательно 20 обьемами каждого иэ следующих растворов:

О,05Н трис-НС1, рН 8,0 (буфер А), 45 содержащий 0,2М хлористый натрий; буфер А, содержащий IМ хлористый натрий; буфер А, содержащий М хлористый натрий и 0,3Z твин-20; буфер А, содержащий 0,2М хлорнсзый натрий, Все промывки и последующую элюцию проводят в бэч-варианте, т.е. перемешиваиием суспеиэии сорбента в обьеме раствора. Осаждение ферритин-сефароэы проводят центрифугированием, как описывалось выше. Элюцию низкоаффиниых антител проводят 8 мл 0,05М глипиц-НГ буфера содержащего О 2Г! хлористый натрий, рН 3, О. Высокоаффинные антитела элюируют в 2 этапа

О, 05И глицин-НС1 буфером, содержащим

0,2И хлористый натрий, рН = 2,3 (по

Ч мл).

К раствору высокоаффинных ан- тител (!б мл) присыпают 500 мг биогеля P (200-400 меш), перемешивают

5 мин при Π— 2 С и центрифугируют

15 мин при 7000 g..Супернатант с концентрацией белка 200-800 мкг/мл собирают, доводят рН до 7,Ь-8,0 и используют как препарат высокоаффинных ферритин-спецнфич;.ых антител, Получение ферритин-специфических антител с помощью известного способа проводят по примеру до стадии кислотной элюции. Элюцию проводят с помощью раствора с рН 3 0 по примеру I u на этом заканчивают процедуру получения антител.

Пример 2. Проведение количественного иммунорадиометрнческяго определения ферритина с помощью препарата ферритин-специфических антител, полученных заявляемым способом, В пробирку вносят 250 мкл раствора подогена (4 мкг) в хлороформе н хлороформ выпаривают в токе аргоиа.

Затем в ту же прббнрку вносят Г,5

2 мКн Na в объеме 40 мкл 0,2Г! трис-НС1 рН 7, S н 100 мкг Ферритинспецифичных антител в объеме 200 мкл

0, IИ трис-НС1, рН 8, О, содержащего

О, !И хлорнстый натрий. Смесь инкубируют 10 мин при комнатной температуре, после чего 1 меченые антитела отделяют от непрореагировавшего гель-кроматографией Hà TSK-геле HWЬО и

" I-меченые фер ритин-специфические антитела используют в иммунорадиометрическом определении ферритина. Лля этого в пробирки вносят ферритин в количестве О, - 25 нг на пробирку. что соответствует концентрации ферритина в исходном растворе 5 — 500 мкг/л

Затем добавляют 100 мкл феррнтин-специфических антител, меченых нзотолом (по 0,03.-0,03 икКи или 5- 18 нг антител) и )00 мкл 0,05М натрий-Фосфатного буфера, содержащего 1Е бычьего,сынороточного альбумипа и 0,02

0,02Х азида натрия. После ннкубацин о в течение 3 ч прн 18 " 25 С или 1 ч при 37 С в про бирк и добавл яхт I 00 лил

1ОХ-ной (мас. /об. ) суспенэпи иммуно15035П8!

15

30

55 сорбеитл, содержлщеro лцтителл к гелезеиочному ферритину, иммобилизонлииые на микрокристлллической целлюлозе, и встряхивают I ч при 18 — 25 С,, Затем суспеизию центрифугируют 15 мин при 2000 g, ослдки промывают 2 мл дистиллированной воды и повторно осаждают. В полученных осадках определяют скорость счета радионуклидл I> отражающую количество связанных с иммуносорбентом комшчексов ферритина со специфическими лнтителлми. В свою очередь этот показатель закономерно сняэан с количеством ферритина, добавляемого с исследуемым раствором.

Количественное иммунорлдиометрическое определение ферритинл с помощью препарата ферритин-специфических антител, полученного известным способом анализ и обработку результатов проводят по примеру 2.

Улучшение качества антител, которое влечет за собой сокращение времени анализа, достигается без потери его чунствительности, точности и достоверности. В большинстве иэ перечислецньм показателей анализ с применением антител к ферритину, полученных заявляемым способом, имеет некоторые преимущества.

П р и и е р 3. Проверка качества препарата антител, полученного заявляемым и контрольным способами, в конкурентном тесте.

Конкурентный тест представляет собой определение особенности препарата антител .конкурировать в иммунорадиометрической системе с I мечеными антителами за связывание с ферритииом. I-меченые антитела, а также иммуносорбент, используемъ|е в иммунорадиометрической системе, получают с помощью стандартной методики, описанной в примере 2. При проведении конкурентного теста в пробирки вносят по 100 мкл раствора ферритина с концентрацией 100 мкг/л. Затем добавляют 100 мкл 107-ной (мас./об.) суспензии иммуносорбента и 200 мкл стандартного буферного раствора (0,05М натрий-фосфатный буфер, содержащий

1Х бычьего сывороточного альбумина и 0,02Х аэида натрия). После инкубации в течение 1,5 ч при 18-25 С и постоянном.встряхивании суспензию центрифугируют 15 мин при 2000 g, осадки промывают 2 мл дистиллированной воды и повторно осаждают. К осадкам прибаяля« т ио 100 мкл рлгтворл, содержащего 10, 1.00, 500 и 1000 иг тестируемых ферритин-специфических лнч тел, что соответствует коицситрлции ферритин-специфических антител и исходном растноре 0,1, 1,5 и 10 мг/мл соответственно, Злтем в каждую ирс— кГУ бирку нносят 100 мкл Т-меченых ферритин-специфических антител cG скоростью счета 50 тыс. имп. /мин и 200 мкл стандартного буфера. Суспенэию нстряхинают 2 ч при комнатной температуре..)атем ее центрифугируют 15 мин при

2000 g, осадки промывают 2 мл дистиллированной воды и повторно осаждают, В полученных осадках определяют скорость скета радионуклида I, отражающую количество связанных с иммуносорбентом комплексов ферритина со

I-меченными антителами (контрольняя проба), а также способность исследуемых препаратов антител конкуриронлть с Е-меченными антителами эа свяэы1 5 ванне с ферритином.

Снижение связанной с иммуносорбецтом радиоактивности при увеличении в среде инкубации концентрации лнтител, полученных заявляемым способом, снидетельствует о конкуренции немечеиьм антиле с мечеными зл связин.зние с ферритином, который в свою очередь биоспецифически связан с иммобилизованными иа целлюлозе антителами. Степень снижения связанной с Иммуиосор— бентом радиоактивности при увеличении концентрации конкурирующих антител отражает лффинность антител.

Таким образом, данный пример показывает, что эаянляемый способ позноляет удалить иэ препарата фепрнтииспецифических антител продукты дест" рук ции фе р ритин а, кото ры е п рис утс твуют, как следует из примера, в препарате, полученном по известному способу.

Анализ экспериментальных данных гримера 3 показывает, что положительный эффект заявляемого способа н сравнении с прототипом заключается в улучшении качества антител, что приводит к уменьшению времени анализа при сохранении показателей его чувствительности, точности и достоверности.

Формула из об ре т ения

Способ получения фсрритин-специфических антител путем проведения хро1503508

Составитель Н. Калинин

Редактор Т. Куркова Техред И,Яндык Корректор N. Васильева

Заказ 571 Тирак Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям прн ГЕНТ СССГ

113035, Иосквв, %-35, Раумская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.ужгород, уи. Гагарина, 1(1 матографии иммунной .аыворотки на ферритине, ковалентно связанной с сефарозой, отличающийся тем, что, с целью повышения чистоты целе5 вого продукта, после хроматографии осуществляют адсорбционную хроматографио на гранулированном полиакриламидном носителе.