Способ определения атакуемости белка пепсином

Способ определения атакуемости белка пепсином

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к медицине , в частности, биологии, и может быть использовано в агропромышленном комплексе, а именно в пищевой промышленности, ветеринарии, зоотехнике и биотехнологии для определения атакуемости белка пепсином. Целью изобретения является повышение точности чувствительности, информативности способа, его упрощение, сокращение длительности определения. Сущность изобретения состоит в том, что к растворам контрольного и испытуемого белков добавляют водный раствор пепсина, через реакционную смесь пропускают слабый высокочастотный ток постоянной силы и по кривым динамики повышения напряжения в цепи в опытной и контрольной пробах судят об атакуемости белка пепсином.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (192 (11) 1бц 4 G 01 N 33/68., Ь. > i 1 . У i L; À

K Øñó. ЕВМЖ\В . %ЕЯЮИИзю:ВИВЕ

ГООУДАРстВенный HQMNTFT

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЬП ИЯМ

ПРИ ГННТ СССР

1 (21) 4314379/28-14 (22) 08,10.87 (46) 15.09.89. Бюл. И - 34 (71) Киевский медицинский институт им. акад, А,А,Богомольца (72) Ю,В.Руль, Т.И.Анистратенко, Г,Н.Яндульская и Д,А.Базыка (53) 6)2,015(088,8) (56) Покровский A.À. Вопросы питания, 1965, Р 3, с,38-4). (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АТАКУЕМОСТИ

БЕЛКА ПЕПСИНОМ (57) Изобретение относится к медицине, в частности биологии, и может быть использовано в агропромышленном комплексе, а именно в пищевой промыш4

Изобретение относится к медицине, биологии и может быть использовано в агропромышленном комплексе, в частности в пищевой промышленности, ветеринарии, зоотехнике, а также в биотехнологии.

Цель изобретения — повышение точ.ности, чувствительности способа, его упрощение и ускорение °

Цель достигается тем„ что к раствору белка,, приготовленному на буферном растворе, поддерживающем оптимальное для реакции пепсин — белок значение рН на уровне 2,1+0,8, добавляют водный раствор пепсина заведомо избыточной активности по отношению к взятому для реакции количеству белка, реагенты перемешивают и через реакционную смесь пропускают слабый высокочастотн и ток постоянной силы, 2 ленности, ветеринарии, зоотехнике и биотехнологии для определения атакуемости белка пепсином. Целью изобретения является повышение точности чувствительности, информативности способа, его упрощение, сокращение длительности определения. Сущность изобретения состоит в том, что к растворам контрольного и испытуемого белков добавляют водный раствор пепсина, через реакционную смесь пропускают слабый высокочастотный ток постоянной силы и по кривым динамики повышения напряжения в цепи в опытной и контрольной пробах судят об атакуемости белка пепсином. 1 табл.

По повышению напряжения в цепи электрического тока, пропускаемого через реакционную смесь пепсин — белок, в сопоставлении с уровнем и периодом повышения напряжения в цепи, замкнутой через реакционную смесь пепсин — эталонный белок (казеин) при прочих равных условиях, определяют показатель атакуемости испытуемого белка (относительно эталонного белка), выражающийся в безразмерных единицах.

Способ осуществляют следующим образом.

Определение проводят на анализаторе ферментативной активности АФ-l, используя следующие параметры высокочастотного тока: частота 880 кГц; сила тока 20 мкА. В кювету, помещенную в термостатируемую ячейку прибора, где А

c10 атакуемость белка пепсином; относительная глубина расщепления„ выражаемая в безразмерных единицах, равная частному от деления величи-. ны Отклонения стрелки милли вольтметра при испытании опытной пробы белка h (мм) на соответствующий показа-тель, полученный при испытании пробы эталонного бел- 50 ка h q (мм); относительная скорость расщепления белка, выражаемая в безразмерных единицах, равная. частному от деления 55 произведения величины отклонения стрелки милливольтметра при испытании опытной

3 1508167 работающУю в режиме +З7 ", вно -ят

1,А мл буферного раствора с концентрацией водородных ионов (рН), равной

2,1 0,8, затем добавляют туда же

0,6 мл рабочего раствора эталонного белка, например казеина, вставляют датчик с двумя электродами и подсоединяют его к прибору, Запись потенциала напряж ния про- 10 изводят на диаграмной ленте самопишущего милливольтметра. Убедившись, что диаграмма параллельна направлению движения ленты, в кювету через отверстие в датчике вводят водный раствор пепсина, 1 мл которого содержит 1 мг кристаллического пепсина, в количестве, большем чем требуется для расщепления данного количества белка. Запись потенциала напряжения производят до 20 прекращения его роста. Аналогично производят запись хода ферментативной реакции пепсин — испытуемый белок. Анализируя кривые, оценивают их конфигурацию, получая при этом важную ин-формацию об интенсивности ферментативного процесса на разных его стадиях, рассчитывают относительную глубину расщепления, относительную скорость расщепления (показатели, имею- З0 щие и важное самостоятельное значение) и атакуемость белка пепсино1 .

Атакуемость белка .1епсином расси.— гьвается по формуле пробы белка и„ и продолжи-: тельности 1 (мин) реакции пенсии — эталонный белок на произведение отклонения

"трелки милливольтметра при испытании контрольной пробы эталонного белка h „ (мм) и продолжитeльности реакции пепсин — опытный белок 1„ (мин) .

П р и и е р 1. Приготовляют пробы эталонного белка и испытуемого белка: 1 г мелкорастертого сухого белка помещают в колбу и добавляют к нему 70 мл дистиллированной воды„ затем при помешивании туда же добавляют 10-1" мл 0,2 н,,раствора едко о натрия, а затем по каллям — 10-12 мл

0,1 н, раствора соляной кислоты до рН 7,0. Полученный основной раствор используют для приготовления рабоче:.о раствора путем разбавления основного раствора в !О раз цитратным буфернък. раствором,. vH KOTo 2,1. Б качестВр эталонного белка используют казеин., Испытанию подвергался белок кормовой микробного происхождения (Р1смП), !

Зпр еделение атакуемости испытуемого белка пепсином проводят при помощи анализатора ферментативной активности АФ-1, За 2 ч цо исследования го -овят рабочий раствор пепсина в вод, для его

20 мг кристаллического пепсииа ðàñòворилн B 20 t ë дистиллированной воды.

После в1слючс hHH анализатора и про1 рева его в течение ЗО мин при режиме термостата - 37 0 в кювету, установ=ленную в ГHeçäÎ териОстата- BH0cRT

0,6 мл рабочего раствора эталонного белка — казеина и 1,4 мл цитратного буФерного раствора рЯ вЂ” 2,1, затем в кювету погружают датчик с двумя электродами и подключают его к прибору.

Производят пробную запись потенциала напряжения при силе тока 20 мкА. убедившись, что диаграмма параллельна направлению движения ленты, в кювету - ерез отверстие в датчике вводят

0,06 мл рабочего раствора пепсина, Запись потенциала напряжения произво-— дят после перемешивания реакционной смеси магнитной мешалкой в течение

20 с, Запись прекращают после выхода диаграммы на направление, параллельное направлению движения ленты сакс5 15081 писца. Аналогично производили запись реакции пепсин — БКМП.

Результаты определения и расчета атакуемости белка БКМП пепсином представлены в табл,! °

Как видно иэ табл.1, показатель атакуемости испытуемого белка БКМП пепсином по отношению к казенну составил 0,4986, что свидетельствует о невысоком уровне атакуемости белка микробного происхождения пепсином, При этом показатель относительной глубины расщепления составил 0,6316, а показатель относительной скорости расщепления - 0,7895.

Пример .2, Способ выполняют аналогично примеру 1, однако исследованию подвергали 10 проб казеина, отобранных из одной партии.

Параллельно были проведены исследования проб белка кормового микробного происхождения БКИП, отобранных из одной партии.

Результаты определения атакуемости белка кормового микробного происхождения (БКМП) в сопоставлении с эталонным белком представлены в табл,2, 10

25

Как видно из табл.2, в серии из

10 параллельных определений атакуемости БКМП относительно казеина результаты с надежностью 95,4% предлагаемым способом можно получить " пог35 решностью 2,9%, При этом показатели глубины расщепления и скорости расщепления БКМП по сравнению с казенном определяются с еше меньшей погрешностью (соответственно 2,25 и 2,75%). Такой уровень погрешности измерений характеризует предлагаемый способ как достаточно точный (воспроизводимый и правиль45 ный) . Относительно невысоким уровнем характеризуются также и показатели рассеяния: сигма и коэффициент вариации, составившие для относительной скорости расщепления относительнои 50 глубины расщепления и атакуемости

БКМП соответственно 0,0364 (4,35%), 0,0238 (3,56%) и 0,0257 (4;58%).

Таким образом, предлагаемый способ по сравнению с известным имеет следующие преимущества: высокая точность (ЬЕ = 2,9%) и чувствительность (1,8 10 белка, Формула изобретения

Способ определения атакуемости белка пепсином путем добавления к раствору испыту-емого и контрольного белка водного раствора пепсина и исследования ферментативной реакции пепсин — белок, отличающийся тем> что, с целью повьппения точности способа, его упрощения и ускорения, дополнительно через реакционную смесь в течение всей реакции пропускают высокочастотный ток постоянной силы, регистрируют динамику глубины и скорости расщепления белка по повышению напряжения в цепи в опытных и контрольных пробах, а атакуемость белка пепсином рассчитывают по формуле

А =

1о Soy где А

re — атакуемость белка пепсином; — относительная глубине расщепления; — относительная скорость расщепления белка.

67 б при 6,0 — 12,0 ° 10 г белка при использовании известного способа) „ регистрация хода реакции на диаграммной ленте самописца по аналоговому типу, в результате чего активность реакции пепсин - белок можно оценить в динамике времени в любой ее точке, что обеспечивает более высокую информативность способа определения атакуемости белка пепсином и позволяет рассчитать показатель атакуемости белка пепсином в сопоставлении с эталонным белком по предложенной формуле (А = Г ° S o), а также обрабатывать данные при непосредственном вводе их в ЭВМ; возможность проведения определения атакуемости пепсином микроколичеств белка (около 18 мкг белка); сокращение продолжительности определения с 3-6 ч по известному способу до 8-12 мин по предлагаемому; сокращение расхода пепсина (кристаллического препарата) и субстрата в 100 — 250 раз по сравнению с известным способом, что особенно важно при изучении атакуемости белка, образцы которого имеются в малых количествах; упрощение способа, достигаемое сокращением числа этапов определения, 1508167 и ц а 1

Т а б л

Время от начала реакции, мин

Казеин

Показатель атакуемости (А) ПродолжительОтклоне- Продолжительность стрелки () 9 мм ность реакции (1к) * мин стрелки (Ь©), мм реакции (4) мин

Я

1 о 1 <

А = — —

1 к 1 о

24 10

ЛГЗ"

= 0,4986

Таблиц а 2

Относительная

Показ аОтноси99 пар проб

Казеин тель атательная глубина расщепления

БКМП

Продолж и т ел ьМаксимальное

Максимальное откло

Продолжительскорость расщепления

БКМП куемости

БКМП пепсином (по казенну) отклоне- ность ность реакции. пепсин - реакции пепсин—

БКМП, мин нение стрелки

Н"39, мм стрелки

Н-39, MM казеин, мин

Статистические показатели:

Х

4- б

+ ш

Сч (X)

95,4 (Ж) 0 6697

0 0238

09О0754

3,56

2 25

0,8365

0,0364

0,01 15

4 35

2,75

0,5599

0,0257

0,00811

4,58

2,90

Составитель A,Cêópàò

Редактор М,Келемеш Техред N.Èîðãåêòàë Корректор М,Самборская

Заказ 5536/48 Тираж 789 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãîðoä9 ул. Гагарина, 101

3

5

7

9

О

4

8

36

38

37

37

38

37

36

38

37

О

16

26

36

38

1l

12

10,5

ll

11

11

10,5

24

26

24

24

О

18

24

24

9

8

8,5

8

7 5

8,5

0,6944

0,б31б

096757

0,6757

0,6848

0,6757

0,6944

0 6316

0,6486

0,6842

0,8488

0,8421

0,8868

0,7949

0,7772

0,8446

0,8488

0,8842

0,8394

0,7982

0,5894

095319

0,5992

0,5371

0,5318

0,5707

0,5894

0,5584

0,5445

0,5462