Способ определения активности антитромбина- @ в плазме крови

Способ определения активности антитромбина- @ в плазме крови

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к медицине , в частности, к гемокоагулологии, и может быть использовано при диагностике нарушений гемостаза. Целью изобретения является повышение точности способа. Для этого исследуемую плазму смешивают со стабилизатором. Затем из нее путем центрифугирования осаждают тромбоциты. Обедненную тромбоцитами плазму дефибринируют нагреванием до 56°С на водяной бане. Затем к раствору тромбина, прогретого на водяной бане при 37°С в течение 2 мин, добавляют исследуемую плазму, инкубируют смесь. Прогревают фибриноген и вносят в него смесь тромбина и плазмы, сразу отмечая время начала реакции, определяют время образования сгустка фибрина, дополнительно проводят пробу с добавлением 0,01-0,02 мл 1%-ного раствора протаминсульфата или 1,0-1,5 мг на 1 мл смеси полибрена. Строят калибровочную кривую для обеих проб, и расчет активности антитромбина-3 проводят с учетом данных дополнительной пробы. Способ позволяет более точно определить активность антитромбина-3, кроме того, он прост и воспроизводим в любой биохимической лаборатории.

СОЮЗ СОВЕТСНИ1(СОЦИЛЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (111 (11 G 01 N 33 86

8260ЮЗНМЯ

",Г, 1Е. . м(1ЕИ6 .;э и . Й i L: —....""

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

М АВТОРСИОМЪ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ HQMNTET

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И 0 П(РЬ1ТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4231374/28-14 (22) 17.04 ° 87 (46) 15. 09. 89. Бюл. 11 ..34 (71) Иосковский медицинский стоматологический институт им. Н.А. Семашко (72) В.Н. Александров, Г.H. Будякова, И„Г. Бобринская, Т.И. Таранова и Л.Ф. Кармолина (53) 616.07(088.8) (56) Hensen А., I.oeliger Е.A. Antithrombin III: Its metabolism and i s

function in blood coagulation. Stuttgart, 1963. In Abildgaard U.p Gravem К., Godal H.„ Thrombos. Diathes, Haemorrh, -1970, v,. 24, N 1/2,. р. 224. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

AHTHTP0HHHHA-III В П!1АЗ11Е КРОВИ (57) Изобретение относится к медицине, ь частности к гемокоагулологии, и может быть использовано при диагности нарушений гемостаза. Целью изобретения является повышение точности способа. Для этого исследуемую

Изобретение относится к медицине, а именно к гемокоагулологии, и может быть использовано в клинико-диагностических и научно-исследовательских лабораториях при диагностике нарушений гемостаза.

Цель изобретения — повышение точности способа за счет проведения дополнительной пробы с добавлением к де— фибринированной бедной тромбоцитами плазме протаминсульфата или полибрена и определения времени образования

2 плазму смешивают со стабилизатором .

Затем из нее путем центрифугирования осаждают тромбоциты. Обедненную тромбоцитами плазму дефибринируют нагреванием до 56 С на водяной бане. Затем к раствору тромбина, прогретого о на водяной бане при 37 С в течение

2 мин, добавляют исследуемую плазму, инкубируют смесь, Прогревают фибриноген и вносят в него смесь тромбина и плазмы, сразу отмечая время начала реакции, определяют время образования сгустка фибрина, дополнительно проводят пробу с добавлением 0,01-0.,02 мп

17.-ного раствора протаминсульфата или 1,0-1,5 мг на 1 мл смеси полибрена. Строят калибровочную кривую для обеих проб, а расчет активности антитромбина-III проводят с учетом данных дополнительной пробы. Способ позволяет более точно определить активность антитромбина-III кроме того, он прост и воспроизводим в любой биохимической лаборатории. сгустка в присутствии тромбина и фибриногена (для представления активности антитромбина-III в процентах строится калибровочная кривая).

Способ осуществляется следующим образом.

Исследуемую плазму смешивают со стабилизатором в обычном соотношении. .Затем из нее путем центрифугирования осаждают тромбоциты. Обедненную тромбоцитами плазму дефибринируют. Де3 1508169 фибринирование производят нагреванием до 56 С в водяной бане.

Растворы для стандартной смеси: раствор тромбина с активностью 1516 с (т.е. в количестве 0,2 мл, спо-собньгй за 15-16 с сверк гть 0,3 мп

О, 4%-HG I o раствора коммерчсского фкбриногена,1; раствор фибркногена 0„4 в буфере Михаэлиса, рН =- 7,8.

Ход определения.

Проба Т, Раствор тромбина инкуубио руют при 37 С и добавляют к нему ис следуемую ппазму, Затеи смесь переносят в раствор.фкбриногена„ прогретого 1„ также до 37 С, замечают время образо.— вания сгустка фи рина в секундах, Проба II, Такую же смесь тромб;"на с исследуемой гглазмой вносят в раствор фибриногена H добавляют раствор 20 протаминсульфата или полибрена. От— мечают время образования сгустка фкб-рина в секундах.

Строят калибровочную кривук> зави-симости активности антитромбина--III "5 и скорости образования сгустка фибри на в смеси тромбин — донорская плаэ— ма — фибриноген, причем донорскую плазму анализируют цельную и pàçBGдят в 2,4 и 8 раз соответственно, 30 принимая активность антитромбина-г1=1 за 100, 25 и 12,5%. Строят дополнительную калибровочную кривую, добав ля1гт BO все разведения протамглсульфа— или полибрен. Эти кривые строятся однажды и при точном нриготовлан1ли буфера могут не меняться.

Эстранолируют время образования сгустка в первой пробе на процент а::-,-тивностк по первой кривой, а время 40 образования сгустка во второй пробе — на процент активности Iio Bторой кривой. Показатели второй гтробы — ак-тивность антитромбина-III.

Пример 1. Из вены больного с,-"

Д., 43 лет, с диагнозом тяжелая черепно-мозговая травма взяли кровь (первые 0,5 мл сливают) к смешали ее

B пластмассовой пробирке с 3,8%-ным раствором цитрата натрия в соотношении 9:1, Центрифугировали при

1500 об/мин в течение 5 мин, Отсосали богатую тромбоцитамк плазму и вновь центрифугкровали при 4000 об/

/мин в течение 20 мин. Отсосали бедную тромбоцитами плазму и прогревали ее на водяной бане при 56 С (этот параметр должен строго соблюдаться) в течение 5 мин, Центриф„гировали

10 мин при 4000 ос/мкн. Надосадочный слой плазмы отсасывали для анализа.

Ход определения.

Проба 1. В пластмассовую пробирKv набирали С, 8 мл p3. I.зоре атоОь GHна. прогревали ка вод,: . Ой бане пр-:

37 С в течеHHP 2 MHH к; сбавляли к нему 0,2 мл исследуемой плазмы. Инкубировали при 37 С в течение 3 мин.

Прогревали 0,„3 мл раствора фибриногео на в течение 1 мин при 37 С и вноси.ли в него смес, тромбина и плазмы

) сразу отмечая время начапа реакции.

ОпрецелялH время образования сгус1ка фибркнв — 75 с, По калибровочной кринол нашли активности ангигрс-бина-"IIT-110%.

Проба 2. В пласт ассовузю пробирку набирали 0,,8 мл раствора громбина, прогревали на водяной бане;зри 37 С

Б течение 2 мик H добавляли K наму

О, 2 мп, тлс1 падуеглой плазмы, смешанной с 0,01 мл 1% -ного коммерческого ра вора про гами11су.пьфата и прсинк бироо „ ванной при 37 С в течение 1 мин. Ик0

«убировали прл 37 С в теченле 3 мин, Прогревали 0 „3 мл раствора фибриноге;Ia в течение 1 мин при 37 С и вноси-ли в него сме. ь громбина и и.;азмы„ сразу отмечая время начала р=акции.

По калибровочко1л кривой ашли актив,о< ть актктромбина-11! с протамин-сульфатом — 63%„ при том, -кго время образования сгустка составляло 42 с, Проба 3. В пластмассовую прооирку набирали 0,.8 мл раствора тромбина„ прогревали на водяной бане г1ри 37 С в " PHåíèå ". мин к добавляли к нему

0,,2 мл иссл -pgpijoH плазмы, предварительно смешанной с полибреном в соотношении 1 мг в . Мл и проинкубировано ный при 37 С в течение i мин. Инкубиров пи при 37 С B течение 3 мин.Прогревали 0,3 мл раствора фибриногена о в течение 1 мин прк 37 С и вносили в него смесь тромбкна и плазмы, сразу отмечая время начала реакции. Определялии время образования сгустка фибрина - "ll с. По калибровочной кривой нашли активность антитромбина-ТТТ с полибреном - 63%. ,пля экстраполяции Bpp!лан1л образо вания сгустка фибрина в активности антитромбина- ГТ1 строится калибровочная кривая.

Для этОГG опредсляют вре11я o6pB =."ÎванкЯ сгустка кибрика в смеси T".5oê"

îлн цельная смссь епаэль 10 здОро

1508169 вых доноров — фибриноген: 60 с. Таким же образом определяют время свертывания сгустка в смеси тромбин плазма доноров, разведенная в 2 раза,— фибриноген: 35 с, затем — время образования сгустка в смеси,, содержащей шазму доноров, разведенную в 4 раза,—

27 с, и разводят смесь донорских плазм в 8 раэ и определяют время образования сгустка — 23 с. Строят кривую зависимости времени образования сгустка фибрина от активности антитромбина-III, условно принимая активность антитромбина-III в цельной смеси до- 15 норских плазм за 1007, разведенной в 2 раза — за 507, в 4 раза — эа 25%, ь 8 раэ — за !2,5Х.

Таким образом, определение активности антитромбина-IIТ по способу-про-20 тотипу (проба 1) показало завьш енный результат (1107), В то же время, тяжесть состояния больного, наличие у него ДВС-синдрома, сопровождающегося гиперкоагуляцией крови и потреблением 25 антитромбина-III — фактора противосвертывающей системы крови, объективно свидетельствовало о снижении активности антитромбина-III.

Анализ по предлагаемому способу 3О (пробы 2 и 3) показал, что активность антитромбина-III у этого больного снижена до 637.- Добавление протаминсульфата или полибрена в пробы позволило подавить активность эндогенного гепарина (присутстние которого замедляло скорость образования сгустка фибрина за счет обгазонания комплексов фибриноген — гепарин или тромбин — гепарин, а следовательно, завышало расчетную активность антитромбина-III) получить действительную величину активности антитромбина-III °

Пример 2. Из вены больной Ч., 32 лет, взяли кровь (первые 0,5 мл 45 сливают) и смешали ее в пластмассовой пробирке с 3,87-ным раствором цитрата натрия в соотношении 9:1. Центрифугировали при 1500 об/мин в течение

5 мин. Отсосали богатую тромбоцитами плазму и вновь центрифугировали при

4000 об/мин в течение 20 мин. Отсосали бедную тромбоцитами плазму и проо грели ее на водяной бане при 56 С (этот параметр должен строго соблюдаться) н течение 5 мин. Центрифугиронали 1 мин при 4000 об/мин. Надосадочный слой плазмы отсасывали для анализа.-, Ход определения °

Проба 1. В пластмассовую пробирку набирали 0 8 мл раствора тромбина.

6 прогревали на водяной бане при 37 С в течение 2 мин и добавляли к нему

0,2 мл исследуемой плазмы. Инкубировали при 37оС в течение 3 мин. Прогре.вали 0,3 мл раствора фибриногена в о течение 1 мин при 37 С и вносили в него смесь тромбина и плазмы, сразу отмечая время начала реакции, Определяли время образования сгустка фибрина — 81 с. По калибровочной кривой нашли активность антитромбина-III

1427.

Проба 2, В пластмассовую пробирку набирали 0,8 MJI раствора тромбина прогревали на водяной бане при 37 С в течение 2 мин и добавляли к нему

0,2 мл исследуемой плазмы, предварительно смешанной с протаминсульфатом в количестве 0,02 мл 17.-ного коммерческого раствора и проинкубированной при 37 С в течение 1 мин. Инкубироо вали при 37 С в течение 3 мин. Прогревали 0,3 мл раствора фибриногена в о течение I мин при 37 С и вносили н него смесь тромбина и плазмы, сразу отмечая время начала реакции. Определяли время образования сгустка фибрина — 37 с. По калибровочной кривой нашли активность антитромбина-III c протаминсульфатом — 417.

Проба 3. В пластмассовую пробирку набирали 0,8 мл раствора тромбина, прогревали на водяной бане при 37 С в течение 2 мин и добавляли к нему

0,2 мп исследуемой плазмы, преднарительно смешанной с полибреном в соотношении 1,5 мг в 1 мл и инкубировали о при 37 С н течение 1 мин. Инкубировао ли при 37 С н течение 3 мин, Прогревали 0,3 мл раствора фибриногена в о течение 1 мин при 37 С и вносили в него смесь тромбина и плазмы, сразу отмечая время начала реакции. Определяли время образонания сгустка фибрина — 36 с ° По калибровочной кривой нашли активность антитромбина-III c полибреном — 41X, Таким образом, при определении активности антитромбина-III по способупрототипу величина активности составляла в примере 1 llOX, в примере 2—

1427, что явилось ложно завышенным результатом иэ-эа присутствия в плазме больных повышенной концентрации эндогенного гепарина (наличие увели1508169

Способ ))+и Разброс

По изобретению

НроТоТНп

60й3,17

98+207

1,8

8,,9 типа.

Способ прост и воспроизводим в- любой биохимической лаборатории. формула и э о б р е т е н и я

Составитель Т. Ковалева

Техред )

Редактор И, Келемеш

Заказ 5536/48

Подписное

Тираж 789

Б1))ИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

1)3035, Москва„ Ж-35, Раушская наб... д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", ".Ó...<ãoð ù„ óä, Г =g,-!b;.-,„,,10, ченного содержания гепарина в плазме было подтверждено анализом по методу

Soulier, 1959), Определение предлагаемым способом показало, что общая антитромбиновая активность составляла в примере

110Х, активность coácòâåíío антитромбина-III - 637..

В примере 2 Обща-- антитромбиновая )p активность составл . ла 1427, активность собственно антитромбина-III — 417.

Зти показатели соотзетствуют тяжести состояния исследованных реанимационных больных. 15

Четко прослежу.-аются ложно завышенные результаты анализов при определении по способу-прототипу. При определении по предлагаемому способу есть воэможность одновременно более 20 точно определить активность собственно антитромбина-III.

Пример 3. Ход определения такой же, как в примере 2, Но в прооу 2 добавляли 0„03 мл )7-ного раст- 25 вора протаминсульфата. Сгустка фибрина не образовалось: В пробу 3 добавляли 2 мг полибрена. Сгустка фибрина не образовалось.

Таким обрезом, .увеличение дозы 30 протаминсульфата или полибрена больше предлагаемой является передоэировкой., при этом сгусток фибрина не образует— ся. Доза протаминсульфата меньше

0,01 мл или полйбрена меньше 1 мг в

35 пробе не инактивирует полностью действие гепарина и дает ложно завышенные цифры активности исследуемого продукта.

Изобретение позволяет повысить точность определения активности антитром-бина-III по сравнению с прототипом (см. таблицу).

Как видно из таблицы, Ошибка (-м)

?07 больше,, -.-ем +3,17., и разброс сигмы (6) 8,9 больше, чем 1,8 по способупрототипу, чем по заявляемому способу соответственно, следовательно, предложенный способ точнее способа-протоСпособ определения активности антитромбина-III s плазме крови путем инкубации тромбина с дефибринированной бедной тромбоцитами плазмой, добавления полученной смеси к фибриногену, определения образования сгустка и расчета активности антитромбина-III, о т л и ч а ю ш и и с я тем, ч-.о 5 с целью пОвышения точности спОсоба„ дополнительно проводят пробу с добавлением 0,01-0,02 мп на 17. раствора протаминсульфата ипи 1,01,5 мг íà 1 мл смеси полибрена, а расчет активности антитромбина-III проводят с учетом данных этой пробы.