Способ разделения и анализа биоорганических соединений

Способ разделения и анализа биоорганических соединений

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано для анализа смесей полимеров и клеток микроорганизмов. Цель изобретения - снижение предела обнаружения. Приготавливают водный элюент, содержащий полиэтиленгликоль, калий фосфорнокислый однозамещенный, калий фосфорнокислый двузамещенный и натрий хлорид. Доводят рН элюента до 7,95-8,0. Емкость с гомогенным элюентом термостатируют при определенной температуре и подают элюент с постоянным расходом в хроматографическую колонку. При этом в потоке элюента образовывается эмульсия. Послеколоночную коммуникацию термостатируют при другой температуре. При этом в ней происходит разрушение эмульсии. Детектирование компонентов смеси осуществляют с помощью флуориметра. 2 ил., 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (511 4 С 01 11 30/Об

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н Д BTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

2 клеток микроорганизмов. Цель изобре= тения — снижение предела обнаружения.

Приготавливают водный элюент, содержащий полиэтиленгликоль, калий фосфорнокислый однозамещенный, калий фосфорнокислый двузамещенный и натрий хлорид . Доводят рН элюента до

7,95-8,0. Емкость с гомогенным элюентом термостатируют при определенной температуре и подают элюент с по стоянным расходом в хроматографическую колонку. При этом в потоке элюента образовывается эмульсия. Послеколоночную коммуникацйю термостатируют при другой температуре. При этом в ней происходит разрушение эмульсии. ф

Детектирование компонентов смеси осуществляют с помощью флуориметра.

2 ил., 1 табл.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4366830/26-25 (22) 18.01.88 (46) 23.09.89. Бюл. - 35 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт биологического приборостроения (72) А.П.Буренин В.В.Помазанов и В.В.Бражников (53) 543.544 (088.8) (56) Anker Н.S. Biochem. Biophys.

Acta, 19 71, 229, I р. 290-291.

Авторское свидетельство СССР

N9 10193289 кл. G О1 N 30/06, 1983. (54) СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ И АНАЛИЗА БИООРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ (57.) Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано для анализа смесей полимеров и

Изобретение относится к области физико-химических методов анализа, преимущественно хроматографии, и может быть использовано для анализа и разделения смесей биополимеров и клеток микроорганизмов.

Целью изобретения является снижение. предела обнаружения.

В предлагаемом техническом решеО нии термостатируемый при 4-25 С гомогенный элюент, представляющий собой водный раствор полимеров и солей, подают насосом в термостатируемую при

4-600С хроматoграфическую колонку, причем температура элюента в колонке отличается от температуры элюента в; предколоночной коммуникации. ВследÄÄSUÄÄ 509726 ствие изменения температуры гомогенный поток элюента превращается в гетерогенный (змульсионный) поток. Для образования гетерогенного элюента непосредственно в колонке в зависимости от качественного состава элюента повышают или понижают температуру элюента в колонке по сравнению с первоначальной. температурой элюента. Разделение целевых продуктов на колонке осуществляют за счет различного их распределения между дисперсной фазой и дисперсионной средой гетерогенного элюента, движущихся с различными скоростями.

Для разрушения эмульсии (превращения гетерогенного потока элюата в ro-1509726 могенный) постколоночную коммуникацию термостатируют при той же температуре, что и емкость с элюентом, или при более низкой (высокой) температуре.

Способ может быть осуществлен с использованием как насадочной, так и полой капиллярной хромато графических колонок.

Поток эмульсионного водно-полимер-10 но — солевого элюата, количественный состав которого близок к критическому, можно обратимо перевести в гомогенное состояние в постколоночной жидкостной коммуникации за счет пере-15 пада температуры в хроматографической колонке и в постколоночной жидкостной коммуникации, что приводит к снижению предела обнаружения способа.

На фиг.1 приведена хроматограмма 20 разделения известным способом 3 мкл раствора лизоцима на нативную и дена— турированную формы; на фиг.2 — то,же, предлагаемым способом.

Способ осуществляют следующим образом.

Пример 1, Приготавливают водный элюент, содержащий 10% полиэтиленгликоля с молекулярной массой

4000, 6% калия фосфорнокислого однозамещенного, 6% калия фосфорнокислого двузамещенного, 0,088% натрия хлорида, рН элюента доводят до величины

7,9 таблетированной гидроокисью калия. Емкость с элюентом устанавливают35 на магнитную мешалку, и при постоянном перемешивании подают эмульсион— ный элюент плунжерным насосом с по. стоянным расходом 0,13 мп/мин в хроматографическую полую капиллярную ко-.40 лонку из кварца. Используют колонку длиной 24 м (внутренний диаметр

0,2 мм) с химически привитой фазой

SE-30 . Приготавливают раствор смеси нативной и денатурированной форм ли- 45 зоцима в 0,05 Y. растворе натрия тетрабората с концентрацией 2,5 мг/мп.

Окрашивают раствор лизоцима раствором флуорескамина в ацетоне с концентрацией 20 мг/мп из расчета 10 мкл < раствора флуорескамина на 1 мл раствора лизоцима. С помощью микрошприца

3 мкл окрашенного раствора лизоцима вводят в петлю крана-дозатора, заполненную гомогейным элюентом. Переключая кран-дозатор, анализируемый образец вносят в колонку без остановки потока элюента. Детектирование осуществляется с помощью флуориметра.

Результаты разделения регистрируют на диаграммной ленте самописца.

Результаты разделения смеси на нативную и денатурированную формы лизоцима показан на фиг.1. Вследствие прохождения через кювету оптического детектора потока эмульсии, характеризующейся неоднородностью по оптической плотности, на диаграммной ленте зарегистрированы высокие флуктуационные шумы. Чем выше флуктуационные шумы, тем выше предел обнаружения способа. Добиться понижения предела обнаружения можно за счет разрушения эмульсии в потоке элюата.

Пример 2. Приготавливают водный элюент, содержащий 9,687. полиэтиленгликоля с молекулярной массой 4000, 4,887. калия фосфорнокислого однозамещенного, 4,887. калия фосфорнокислого двузамещенного, 0,0887натрия хлорида, рН элюента доводят до величины 7,95-8,0 таблетированной гидроокисью калия. Емкость с гомогенным элюентом термостатируют при о

20 С и плунжерным насосом подают элюент с постоянным расходом

0,13 мл/мин в хроматографическую полую капиллярную колонку из кварца.

Используют колонку длиной 24 м (внутренний диаметр 0,2 MM) с химически привитой фазой SE-30 . Колонку термостатируют при 60 С для образования эмульсии в потоке элюента. Постколоночную жидкостную коммуникацию хроматографа термостатируют при 4 С для о разрушения эмульсии в потоке элюата.

Приготавливают раствор смеси нативной и денатурированной форм лизоцима в 0,05 М растворе натрия тетрабората с концентрацией 2,5 мг/мл. Окрашивают раствор лизоцима раствором фпуорескамина в ацетоне с концентрацией

20 мг/мл из расчета IO мкл раствора флуорескамина на 1 мл раствора лизоцима. С помощью микрошприца 3 мкл окрашенного раствора лизоцима вводят в петлю крана-дозатора, заполненную гомогенным элюентом.

Переключая кран-дозатор, анализируемый образец вносят в колонку без остановки потока элюента. Детектирование и регистрацию осуществляют, как описано в примере 1. Результаты разделения анализируемого образца лизоцима на нативную и денатурированную формы предлагаемым способом показаны на фиг,2. За счет перепада темпе1509726

Кратность понивення обнарувеНМЯ СПО" собв

Температура

ПО CTKO папочной

Темперв7У в хромвтогрвфичсс" хой ко" лонкн, С

Температурур предколоночной коммунн кации, С роматотрафическая холонхв, Состав адвента, всход злвентв

При- Аналнзируеюв1 обрв нер зец коммуникации, С

20 60

ЛЭГ-4000 4,68

К71тРО4 4,88

К ПРО, 4,88

Нас1 0,088

Днстиллнро ванная во-. да 80,552 рН 8,0

ПЗГ 4000 10.

КН РОт 1,583

К HPOе 8,968

ФнзнОЛО тн чесюб1 раствор 79,449 рН 7,6 „

Дехстран

500000 8,19

ПЗГ-4000 4уЗ

Фосфатннй буфер рН

Полая капнллярная холопка . из кварца. Плинв 24 н, внутренний диаметр 0,2 мм, с химически лривнтОй фвзОй

$8-30. Расход злвеитв

0,1З /

Раствор смеси натннной и денатурированной форм лизоцима

17 55

2 Смесь суспензий клетох Eachecichia

oil 1257 í Eachari chi a cali И-17

Колонка насвдочнае из иеркввеввей стали 0,2в25 см.

НОснтель из стекла с частицани размером 125-177 мки, диаметр пор 85 1.

Расход злввнта О, 127мл/мни .

З,2

24 4 50

3 Раствор смеси РНК и ДИК

Колонка нвсвдочнак из перхавеюией стали 0,2425 см, Носитель из стекла с частнцани рвзмерон 125-177 мхм, диаметр пор 85 А.

Расход злвента0,15 мл/мнн. аа,51

7,1 ратуры в постколоночной жидкостной коммуникации хромато графа разрушается эмульсия в потоке элюата. Поток элюата становится гомогенным, опти5 чески однородным и при прохождении через ячейку оптического детектора не вызывает больших флуктуационных помех. Как видно из сравнения хроматограмм на фиг,1 и 2, предел обнаружения способа снижается в 4 раза по сравнению с пределом обнаружения при проведении разделения без разрушения эмульсии в потоке элюата.

Примеры осуществления способа и . данные кратности понижения предела

1обнаружения биоорганических соединений предлагаемым способом приведены .в таблице.

Снижение предела обнаружения позволяет использовать способ в практике заводских лабораторий для определения содержания микроколичеств био-! органических примесей в продуктах и, полупродуктах биотехнологического 25 производства, для обнаружения микроколичеств выбросов в окружающую среду продуктов и отходов биопроизводства, в котором используются микробы— продуценты биологически активных веществ. На базе способа возможно создание специализированного жидкостного хроматографа для заводских лабораторий.

Формула и з о б р е т е н и я

Способ разделения и анализа биоорганических соединений, включающий экстрагирование анализируемых вещест13 череЪ хромаграфическую колонку пото-ком водно-полимерно-солевого эмульсионного элюента и детектирования разделенных компонентов смеси, о т— л и ч а ю шийся тем, что, с це-лью снижения предела обнаружения з, водно-полимерно-солевой эмуль сионный

1элюент перед детектированием превра1щают в гомогенный раствор за счет прохождения его через другую температурную зону, а количественный состав водно-полимерно-солевого элюента вы"бирают близким к критическому.

1509726

Корректор А. Обручар

Заказ 5799/38 Тираж 789 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, R-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101 с а Р9 фену, юМ юг. 7

Составитель П.Домнин

Редактор В.Данко Техред М.Моргентал

0 12 2Ф д/ Рю true

4Ьг. Е