Способ радиоиммунологического определения эстрадиола в сыворотке крови и инкубационная среда для его осуществления

Способ радиоиммунологического определения эстрадиола в сыворотке крови и инкубационная среда для его осуществления

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к медицинскому радиоиммунологическому микроанализу и может быть использовано в биохимии и медицине для ранней диагностики и контроля за лечением эндокринных заболеваний. С целью упрощения определения, повышения его чувствительности и расширения диапазона определяемых концентраций эстрадиола проводят инкубирование анализируемой и контрольной проб с антителами к эстрадиолу и <SP POS="POST">3</SP>Н-эстрадиолом в присутствии дигидротестостерона, отделяют связанный с антителами эстрадиол от свободного эстрадиола с помощью адсорбента, радиометрии супернатанта и определяют концентрацию эстрадиола по калибровочной кривой, по которой рассчитывают содержание сыворотки крови мужчин с концентрацией эстрадиола менее 0,1 нмоль/л. Состав содержит компоненты в следующем соотношении, мас. %: антитела к эстрадиолу 4,5<SP POS="POST">.</SP>10<SP POS="POST">-6</SP> - 5,5<SP POS="POST">.</SP>10<SP POS="POST">-6</SP>, трис (оксиметил)аминометан (ТРИС) 1,1,-1,3, HCI (α<SB POS="POST">24</SB> = 1,16) 0,29-0,31, <SP POS="POST">3</SP>нэстрадиол с удельной активностью 3,4-3,7 ТБк/ммоль 2,1<SP POS="POST">.</SP>10<SP POS="POST">-9</SP> - 3,1<SP POS="POST">.</SP>10<SP POS="POST">-9</SP>, дигидротестостерон 2,8<SP POS="POST">.</SP>10<SP POS="POST">-6</SP> - 3,0<SP POS="POST">.</SP>10<SP POS="POST">-6</SP>, сыворотка крови мужчин с содержанием эстрадиола менее 0,1 нмоль/л 19-21, дистиллированная вода - остальное. 2 с.п. ф-лы.

СОЮЗ СОБЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

<д11 1 G 01 N 33/60

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ П.(КТ СССР! (21) 4064851/28-1 4 (22) 29 .04.86 (46) 23.10.89. Еюл. 39 (71) Институт биоорганической химии

АН БССР (72) А.Г.Прядко, Т ° В.Карпова, Н.А.Борисова, О.Н.Суслов и В.Д.Иатвеенцев (53) 612.015 (088.8) (56) .Clin. Fndocrinol Hetab

1975, ч. 40, р. 19-25. (54) СПОСОБ РАДИОИ!1ИУНОЛОГИЧЕСКОГО

ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭСТРАДИОЛА В. СЫВОРОТКЕ

КРОВИ И ИНКУБАЦИОННАЯ СРЕДА ДЛЯ ЕГО

ОСУ!!1ЕСТВЛЕНИЯ (57) Изобретение относится к медицинскому радиоиммунологическому микроанализу и может быть использовано в биохимии и медицине для ранней диагностики и контроля за лечением эндокринных заболеваний ° С целью упрощения определения, повышения его чувствительности и расширения диапазона определяемых концентраций эстраИзобретение относится к медицине, в частности к радиоиммунологическому микроанализу, и может быть использовано для определения эстрадиола в сыворотке крови.

Целью изобретения является упрощение определения и повышение чувствительности за счет приготовления калибровочных проб на сыворотке крови мужчин с концентрацией эстрадиола менее 0,1 нмоль/л и использования дигидротестостерона в качестве ингибитора эндогенных связывающих белков.

„„Я0„„516983 A 1

2 диола проводят инкубирование анализируемой и контрольной проб с антителами к эстрадиолу и Н-эстрадиолом в присутствии дигидротестостерона, отделяют связанный с антителами эстрадиол от свободного эстрадиола с помощью адсорбента, радиометрии супернатанта и определяют концентрацию эстрадиола по калибровочной кривой, по которой рассчитывают содержание сыворотки крови мужчин с концентрацией эстрадиола менее 0,1 нмоль/л.

Состав содержит компоненты в следующем соотношении, мас.7: антитела к эстрадиолу 4,5 «10 — 5,5 ° 10 трис

6 . — 6 (оксиметил) аминометан (ТРИС) 1, 1 — I, 3, НС1 (о, = 1, 16) О, 29-0, 31, Н-эстрадиол с удельной активностью 3, 43, 7 ТКк/ммоль 2, 1 ° 10 -3, 1 - 10, дигидротестостерон 2,8 10 -3,0 10 — 6 — б сыворотка крови мужчин с содержанием эстрадиола менее 0,1 нмоль/л 19-21, дистиллированная вода — остальное.

2 с.п. ф-лы, I табл.

Пример I . Готовят реагенты, необходимые для проведения анализа: трис-НС1 буферный раствор, О,! 1 ., б рН 8,0, содержащий 2,9 !О 7 дигидротестостерона, 100 ; стандартные растворы эстрадиола на сыворотке кро— ви мужчин с конечной концентрацией эстрадиола О, 0,1, 0,3, I, 3, 10 нмоль/л по 0,2 жт; раствор Н-эст3« радиола с удельной активно с т1 3, 43, 7 ТБк/ммоль, содержагпЮ О вЂ” 33 кБк в 10 мл буферного раствор;; т,.створ кроличь их антител к ко апп,ю ; ту с тра3 i 5l 6983 диол-6 (О-карбоксиметилоксим) -бычий сыно роточный аль бумин (Р -6-!Г О-! СЛ) 2 в разведении, способном связать, 507, внесенного в пробу меченого эстрадио5 ла, 10 мл; суспензию активиропанного угля, покрытого декстраном (10:1 по весу), содержащую 5 r угля на 100 мч дистиллированной воды, охлажденную до 2-4 С на ледяной бане. !О

Проведение анализа.

Б аналитические пробирки, маркиро— ванные - 1-16, вносят по 0,05 мл растворов калибровочных проб (таблица). В аналитические пробирки, мар- !5 кированные h 17 †1, вносят по

0,05 мл образцов сыворотки крови, предназначенной для количественного определения эстрадиола, Бо все пробирки, кроме N - 1-4, вно — 20 сят по 0,1 мл антисыворотки. Б пробирки !1- 1 и 2 вносят по 0,65 мл, а в !Ф 3 и 4 — по 0,1 мл буферного раствора. Все пробирки встряхивают на вихревом смесителе. Инкубируют пробирки при комнатной температуре (18—

25 С) в течение 1 ч, а затем на ледяной бане (0-4 С) в течение 15 мин.

Стакан с охлажденной суспензией активированного угля помещают на маг в 30 нитную мешалку и при постоянном перемешивании вносят во все пробирки, кроме h 1 и 2 по 0,5 мл суспензии.

Пробирки с углем выдерживают 10 мин на ледяной бане, периодически встря— хивая.

Пробирки, обработанные активированным углем, одновременно центрифугируют при комнатной температуре в центрифуге с горизонтальным ротором 40 при ускорении 1500-2000 g в течение

10 мин.

Из каждой пробирки отбирают по

0,5 мл надосадочной жидкости и переносят во флаконы для счета, содержа- 45 щие по 5 мл сцинтилляционной жидкости ЖС-7. флаконы помещают в счетчик и измеряют скорость счета в каждом из них в течение 1 мин.

Схема анализа приведена в таблице. 50

". àñ÷eòû и графические построения, Находят среднее арифметическое

3 скоростей счета Н-эстрадиола для каждой пары пробирок. Рассчитывают

/ величину Б /Б для каждой калибровоч-55 ной и неизвестной пробы по формуле

В /Б. — (. Б„)/(Б, Б„) 100, где  — средняя скорость счета в пробирках с калибровочными или неизвестными пробами (N 7, 8,..., 99, 100);

Б, — средняя скорость счета в пробирках, содержащих пробу

О нмоль/Jl (!! 5 и 6);

В, — средняя скорость счета в про— бирках, не содержащих антисыворотки (h 3 и 4) .

Рассчитывают соотношение В /Т, где Т вЂ” общая активность Н-эстрадио3

Jla измеренная средней скоростью счета в пробирках Р 1 и 2. Значение

Bo/Т должно лежать в пределах 30-65Л, В полулогарифмических координатах строят график зависимости B /Â (ось

I ординат) от концентрации эстрадиола в калибровочных пробах (ось абсцисс) .

Для неизвестных проб сыворотки крови по калибровочному графику определяют концентрацию эстрадиола.

Лналитические характеристики метоД cl °

Специфи и ость анализа. Суммарная перекрестная реакция антисыворотки к эстрадиолу cG структурно-родственными стероицами, определенная по методу Abraham, не превьппает 27.

Точность . Процент открытия стандартной добавки эстрадиола к образцам сыворотки крови с высоким, низким и средним содержанием гормона составляет 95-1067. . 1инейность. Зависимость снижения уровня эстрадиола от степени разбавления исходного образца сыворотки крови при использовании предлагаемого метода носит линейный характер.

Сходимость и воспроизводимость результатов анализа. Коэффициент вариации для 10 определений содержания эстрадиола в одном и том же образце сыворотки крови не превышает

103, а в разных экспериментах — 207..

Елиническая проверка. Еонцентрации эстрадиола в сыворотке крови мужчин и женщин, находящихся в различных физиологических состояниях, со— ответствуют данным литературы.

Чувствительность определения (минимальная детектируемая доза) составляет 0,05 нмоль/л эстрадиола.

Пример 2. Инкубационная среда для радиоиммунологического определения эстрадиола в сыворотке крови человека при следуюпем соотношении компонентов, мас.Е:

151 6983 6 в присутствии ингибитора эндогенных связывающих белков, отделение связанного с антителами эстрадиола от сно5 бодного эстрадиола обработкой активированным углем, покрытым декстраном, с последующим центрифугированием, радиометрию супернатанта и определение концентрации эстрадиола по калибро1р ночной кривой, о т л и ч atom, и йс я тем, что, с целью упрощения оп— ределения и повышения его чувствительности, используют калибровочные е- пробы, содержащие сыворотку крови

15 мужчин с концентрацией эстраднола и менее 0,1 нмоль/л, исследование про-водят в инкубационной среде, содержащей антитела к эстрадиолу, -Н-эстрадиол и дигидротестостерон, инкубио

20 рование осуществляют при 18-25 С.

2. Инкубационная среда для радиоАнтитела к эстрадиолу 4,5 10

Трис (гидроксиме тип)— аминометан l,l

НС1 (й = 1,16) 0,29

Дигидротестостерон 2,8 ° 10

3 9

Н-эстрадиол 2,1 ° 10

Дистиллированная вода Остальное

Аналитические параметры системы соответствуют данным, приведенным в примере 1.

Пример 3. Инкубационная ср да для радиоиммунологического определения эстрадиола в сыворотке кров человека при следующем соотношении компонентов, мас.7.:

Антитела -к эстрадиолу 5,5 ° 10

Трис (гидрок симе тил)— аминометан 1э3 го 1,16) 0,31

Дигидротестостерон 3,0 10

-9

3Н-эстрадиол 3il ° 10

Дистиллированная вода Остальное

Чувствительность анализа составила 0,052 нмоль/л. Остальные аналитические параметры соответствуют данным, приведенным в примере 1.

Предлагаемый способ дает возможность повысить чувствительность определения эстрадиола до 0,05 нмоль/л (по известному способу 0,18 нмоль/л), а также упростить процедуру определения благодаря ее проведению без учета неспецифического связывания в не из вест ных и ро бах .

4,5 10

5,5 ° 10 лу

Трис (оксиме тил)— аминометан

Н-эстрадиол с удельной активностью 3,43,7 Твк/ммоль

1,1-1,3

Формула изобретения

2,1 10

3,1 10

2,8 10

-6

3,0 10

1, Способ радиоиммунологического определенияя эс традиола в сыворотке крови, включающий инкубирование анали- 45 зируемой и контрольной проб с антителами к эстрадиолу и Н-эстрадиолом

Дигидротестостерон

Дис тиллиро ванная вода

Остальное а

Н-аст- ii голь, 1

| вал пол, мк 1

АнтисыворьтБуферньпэ раНеизвеПро бирки ст ные обраэ— иы, мкл ка, мкл мкл

001,031310 створ, м кл

1ОО

1ОО

I oo

1ОО

lOO

lOO

1ОО

100

1ОО

1,2

3,4

5,6

7,8

7,1О

11,l2

13,14 т

Вн

Ро

Hot в, в

5ОО

5ро

500 ,Г о

5оо

I 00

1ОО

100

50

50

На яе ряе- 1 Калибровочные пробы чая ве— (нмоль/л), мкл иммунологического определения эстрадиола в сыворотке крови, содержач1ая эстрадиол, меченый Н, буферный раст25 вор, антитела к эстрадиолу и ингибитор эндогенных связывающих белков, отличающаяся тем, что, с целью упрощения определения и повышения чувствительности, в качестве ин30 гибитора эндогенных связывающих белков используют дигидротестостерон при следующем соотношении компонентов, мас.7.:

Антитела к эстрадио! 516983

Продолже ние таблицы

Нг изве—

ПробггрГуферный раУголь, мкл кн створ, и кл мкл

I OO I OO 500

I00 )00 500

l5,I6

l7-lO0

Вм

50

Составитель В. Гудошников

Редактор И.Горная Техред Л.Сердшкова КорректорИ.Шароши

Заказ 6387/49 Тираж 789 Подписное

ВШП1ПИ Государственного комитета по изс>бретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113П35, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101

Иэмеряемагг величина

Калибровочные пробы (ггмоль/л), мкл

") (1 >О стггвг образ— цы, мкл

Ан тисыворот— ка, мкл э

Н-эстрациол,