Способ получения иммобилизованного трипсина

Способ получения иммобилизованного трипсина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению иммобилизованного трипсина. Цель изобретения - упрощение процесса и повышение стабильности иммобилизованного трипсина. Способ заключается в обработке ферромагнетита с диаметром пор 80... 100А J-аминопропилтриэтоксисиланом до достижения концентрации первичных аминогрупп 140...200 мк/моль на 1/г сухого носителя, модифицировании полученного производного глутаровым альдегидом, взятым в 25...30 - кратном избытке по отношению к концентрации первичных аминогрупп носителя, связывании трипсина с носителем. Способ позволяет упростить процесс получения иммобилизованного трипсина, а также увеличить его стабильность.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУ БЛИН (gg 4 С 12 N 11/00, 11/14!

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4308764/31-13 (22) 01.10.87 (46) 30.10.89. Бюл, У 40 (71) Вильнюсский государственный университет им. В. Купсукаса (72) В.Г. Бендикене, А.А, Раэюнас и Б.А. Иодка (53) 577.15(088.8) (56) Введение в прикладную энциклопе., дию/Под ред. И.В. Березина и К. Мартинека. М., МГУ, 1982, с, 112.

F.. van Leemputten and М, Horisberger. Immobilization of enzymes on

magnette particles. — Biotechnol.

Bioeng. Vol. XYI, р. 385-396, 1974. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОГО ТРИПСИНА (57) Изобретение относится к бнотехИзобретение относится к биотехнологии, в частности к способам полу- чения иммобилиэованных белков,и мощет найти применение в химической, фармацевтической, пищевой промьззленнос" ти и в медицине для проведения ферментативных реакций.

Цель изобретения - упрощение процесса и повышение стабильности иммобипизованного трипсина.

Способ заключается в обработке ферромагнетита с диаметром пор 80100 А 1аминопропилтриэтоксисиланом (y-АПТЭС) до достикения концентрации первичных аминогрупп 140-200 мкмоль на 1 г сухого носителя, модификации полученного производного глутаровым

„„SU„„1518373 А 1

2 нологии, а именно к получению иммобилиэованного трипсина. Цель изобретения — упрощение процесса и повышение стабильности иммобилизованного трипсина. Способ заключается в обработке ферромагнетита с диаметром пор 80-100 А -аминопропилтриэтоксиснланом до достикения концентрации первичных аминогрупп 140-200 мкмоль на 1 г сухого носителя, модифицирование полученного производного глутаровым альдегидом, взятым в 25-30кратном избытке по отношению к концентрации первичных аминогрупп носителя, связывании трнпсина с носителем. Способ позволяет упростить процесс получения иммобилизованного трипсина, а такыре увеличить его стабильность, Ь альдегидом, взячъм в 25-30 кратном Ql избытке по отношению.к концентрации . ®,в первичных аминогрупп носителя, свя- р зывании трипсина и удалении несвяэаваегося белка отмыванием, Использование укаэанных приемов позволяет иммобилизовать трипсин на носителе с ферромагнетитными свойствами и получить крайне стабильный препарат, сохраняющий неизменную активность в течение 24 мес и 50Х активности через 36 мес. ю640

Предлагаемый способ проще известного, так как стадия активации носителя сокращена на одну стадию и в процессе активации исключено использование токсических веществ.

1518373

Пример 1. Получение ферромагнетита. Частицы ферромагнетита коллоидных размеров получают осаждением водных рас.творов смеси солей двух5 и трехвалентного железа, выбранных из групп сульфатов и хлоридов, растворами щелочи по известным методикам.

28 г сернокислого закисного желе- f0 эа (Fe80q 7H>0) растворяют в 750 мл воды и 55,5 г III-хлорного железа (РеС11 бН,,О) растворяют в 750 мл воды, Полученные растворы смешивают при комнатной температуре и з1у смесь 15 вводят в 150 мл (избыток NHqOH составляет 277 от зквимолярного количества раствора аммиака) 257,-ного раствора аммиака. Полученную смесь перемешивают и отстаивают в течение

1,5 ч, жидкость над осадком сливают в количестве 1,15 л, что составляет

707 маточного раствора, быстро промывают двумя порциями воды по 500 мл, 300 мл ацетона, порциями по 150 мл 25

СМЕСИ аЦЕтОН- оПОЛ (В СООТНОШЕНИИ

4:i 3:2, 2:3, I 4) и дважды толуолом по 150 мп и быстро используют для дальнейших опытов. Диаметр fop феро омагнетита 80-100 А. 30

Силанизация ферромагнетита. Полученный магие тит высушивают" (придерживая его постоянным магнитом) фильтровальной бумагой, взвешивают и переносят в круглодонную трехгop " 3.) лую колбу, снабженную механиче ..кой мешалкой, термом= òðîì и холодипьни-ком, К магие т1 1у приливают раствор

1-АПТЭС в толуоле (соотношение весовых количеств магнетита, у-АПТЭС 40 и толуола 1:1:Ifi) и кипятят при тем-пературе кипения растворителя в течение 10-25 ч (с перерывами). После охлаждения смеси магнетит придерживают постоянным магнитом, Раствор 45 сливают, осадок промывают толуолом (порциями по 100 мл 5-6 раэ), затем тщательно этиловым спиртом (по 100 мп

3-5 раз) и высушивают при комнатной температуре в чашке Петри.

В силанизированных образцах магнетита (в зависимости от продолжения времени реакции с 1 -АПТЭС) определяют концентрацию первичных аминогрупп в 1 г сухого магнетита, измеряя УФ-поглощение этанольного раствора салицилового алвдегида до реакции с образцами и после нее. Затем рассчитывают концентрацию свободных первичных амиио1 рупп в мкмопях на 1 I сухого магнетита ..

При продолжении реакции силанизации до 30 ч количество первичных аминогрупп на поверхности носителя не увеличивается„ Поэтому продление реакции сверх 25 ч нецелесообразно зкономической точки зрения, Е зависимости or времени обработки 1--АПТЭС концентрация аминогрупп варьирует от

70 до 200 мкмоль на i г носителя.

2,3 г силанизированного магнетита с концентрацией первичных аминогрупп

70 мкмоль/г промывают водой, заливают 25-кратным избытком (1,б мк) (по отношению к молю первичных аминогрупп) глутарового альде1ид» (25кратный избыток глутарового альп ги-да Ira моль первичных NH.,— гру1.п пОдобран I.o Hçáåêàíèå кросспинкинга между двумя молекулами носителя и ifoпекулы диальдегида ). Затем ириба11ляют

5,4 мл воды, перемешивают i ч при комнатной температуре, промыва1в1 водой путем декантации, придерживая магнетIIT постоянным магнитом, затем двумя порциями по 15-20 мл 0„02

CcI (CH 1СОО) 1 ° K влажHot . у модиф11циро ванному глутарал. Де идом -i-ди,qHIIIIрованному M,àãèoòrr ú. Ирибавляь," б мл раство1 а трипси1 а (концентр.111ия белка 5 мг/:1л) в 0,002 М ".а ((.Ii -, 0C 1, .

Сусп"азию,1еремешивают и,-, л :1я,1ой

61не г течение 2 ч,, Г11гне . z ы .,; 1мыВаш . ПаЧ a,.I Hbfrf 6 1rgeP»r-I f P . Zrio qo.!

qo о г утствия г,pof,ывных ironrrx бв .— к» > измеряемого при дпи 1» вoпны

280 нм,.

II р и м е р 2,. 2,3 г ипаиизир ванного магнетита с ко;цer!1.pацией первичных аминоггупп 140 мкмогь/г, промывают водой, заливают 4 мл глутарового альдегида, 3 мл воды, перемешивают 1 ч при комнатной темпер -yре, промывают водой путем декантации, придерживая магнетит постоянным магнитом, затем двумя порциями по 1520 мл 0,002 М Са(ГНэСОО)1, (влажному глутаральдегидом модифицированному магнетиту прибавляют б мл ра< та:ра трипсина (концентрация белка

5 мг,/мл) в 0,002 М Ca(CH>Cfr0) Суспензию перемешивают на ледяной бане в течение 2 ч. Магнетиты промывают начальным буфернь|м раствором дo OT сутствия в промывных водах белка, измеряемого при длине волны 280 им.

8373

15

35 тью при хранении.

5 151

Пример 3. ?, 3 г силаниэированного магнетита (пример 2) с концентрацией первичных аминогрупп

180 мкмоль/г, промывают водой, заливают 4,1 мл глутарового альдегида, 2,9 мл воды, перемешивают 1 ч при комнатной температуре, промывают водой путем декантации, придерживая магнетит постоянным магнитом, затем двумя порциями по 15-20 мл 0,002 М

Са(СН„СОО) . К влажному глутаральдегидом модифицированному магнетиту прибавляют 6 ип раствора трипсина (концентрация белка 5 мг, MJI) в

0,00? М Са(СН„СОО), Суспензию перемешивают на ледяной бане в течение

2 ч. Магнeтитbl промывают начальным буферным раствором до отсутствия в пр мывных водах белка, измеряемого по длине волны "80 нм.

Пример 4-. ?,3 силанизированно о магнетита (пример 2) с концентрацией первичных аминогрупп

200 мкмоль/г, промывают водой, заливак т 5,б мл глутарового альцегида, 1,4 мл воды, пере:.вмешивают 1 ч при комнатной емпературе, промывают водой путем декантации, придерживая магнетит постоянным магнитом, затем двумя порциями по 15-20 мл 0,002 М

Са (СН СОО) . К влажному глутаральдегидом модифицированночу магнетиту прибавляют 6 мл раствора трипсина (концентрация белка 5 мг/мл) и 0,02 М

Са(СН зСОО) . Суспенэию перемешивают на ледяной бане в течение 2 ч. Магнетиты промывают начальным буферным раствором до отсутствия в промывных водах белка, измеряемого при длине волны 280 нм, В зависимости от концентрации первичных аминогрупп на поверхности силанизированного магнетита (при сохранении идентичных условий иммобилизации для всех исследуемых образцов) резко меняется количество иммобилизованного белка, Так, при концентрации 70 мкмоль/г, иммобилиэуется лишь 0,45 мг/г, а при концентрации 140, 180 и 200 мкмоль/г — 1,8;

2,5 и 2,8 мг/г белка соответственно.

Таким образом, оптимальным количеством первичных NH -групп для свяэывания наибольшего количества белка является 140-200 мкмоль на 1 г сухого носителя. Кроме того, верхним пределом концен -рации является как раэ

200 мкмоль/г, так как при продолжении времени силаниэации больше ?5 ч, количество вводимых аминогрупп не меняется. Эффективность иммобилизации при добавлении 25- или 30-кратного избытка глутарового альдегида одинакова.

Эстеразную активность определяют со специфическим субстратом 4-нитроанилидом-N-бенэ оил-И,-аргишгна (БАр! !А) .

Удельная активность трипсина определяется количеством мкмолей п-нитроанияина, образовавшегося во время ферментативного гидролиза субстрата

3а 2 мпн при 37 С, при РН 8,? на 1 мг белка °

Полученный препарат иммобилиэованного трипсина хранится в течение двух лет без потери активности, а,- через три года его активность снижается н 50/..

Термостабильность полученного препарата в ппе известного при температуре 60 С в течение 1 ч, активность препаратов падает соответственно на

50 и 70 .

Таким образом, использование пред:тагаемого способа позволяет существенно упростить процес попучения целевого продукта эа счет исключения одной стадии активации носителя и проведения процРсса без использования токсических веществ. Кроме того, полученные препараты иммобилизованного три;c.èíà облаттаlQò говьппенной тер мостабильностью и высокой стабильносФормулаиэобретения

Способ получения иммобилизонанного трипсина, вкпючающий обработку

Ьерромагнетита т -аминопропилтриэтоксисиланом, модифицирование полученного производного химическими реагентами, присоединение трипсина и отмывание несвязавшегося белка, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью упрощения процесса и повышения стабильности целевого продукта, используют ферромагнетит с диаметром пор

80-100 A., обработку ферромагнетита †аминопропилтриэтоксисиланом ведут до достижения концентрации первичных аминогрупп 140-200 мкмоль на I г сухого носителя, а модифицирование полученного производного проводят глу1518373

Составитель В, Иуронец

Редактор М. Петрова Техред М.Ходанич Корректор П . Патай

Заказ 6568/31 Тирам 501 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101 таровым альдегидом, взятым в 2530-кратном избытке по отношению к концентрации первичных аминогрупп носителя..