Способ получения иммобилизованной галактозооксидазы

Способ получения иммобилизованной галактозооксидазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам иммобилизации ферментов на неорганических носителях, и может быть использовано для определения галактозосодержащих углеводов в пищевой промышленности и медицине. Цель изобретения - упрощение способа и увеличение активности иммобилизованной галактозооксидазы. Способ заключается в смешивании буферного раствора галактозооксидазы с кремнеземом, содержащим аминопропильные группы, в присутствии 0,9-2,88 г галактозы на 1 г носителя, при этом галактоза окисляется ферментом до 2,4-галактогексодиальдозы, которая обеспечивает сшивку фермента с носителем. Положительный эффект достигается при добавлении 80-115 ед. активности фермента на 1 г носителя. Использование способа упрощает процесс иммобилизации и увеличивает активность целевого продукта. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (51) 4 С 12 И 11/14 11/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОЧНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4288226/31-13 (22) 21.07.87 (46) 15.11.89. Бюл. У 42 (71} Институт химии поверхности

АН УССР (72) Л.В.Кондакова, В.А.Тертых, В.В.Янишпольский, Т,Т.Буглова и О.В,Скоробогатько (53) 577.15 (088 ° 8) (56) Тертых В.А., Янишпольский В.В.

Химические аспектЫ иммобилизации ферментов на неорганической матрице.

Адсорбция и адсорбенты, 1980, 8, с.3-27.

Кондакова Л.В. и др. Некоторые свойства галактозооксидазы из

Fusarium graminearum ИНВ-7-91060, иммобилизованной на аминоорганосилохромах. — Укр.биохимичекий журнал, 1984, т.56, 94, с.394-398. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИМИОБИЛИЗОВАННОЙ ГАЛАКТОЗООКСИДАЗЫ (57} Изобретение относятся к биотехноИзобретение относится к биотехнологии, в частности к способам иммобилизации ферментов на неорганическом носителе, и может быть использовано для определения галактозосодержащих углеводов в пищевой промышленности (молочной, сахарной, спиртовой) и медицине. . Цель изобретения — упрощение способа и увеличение активности иммобилизованной галактозооксидазы.

Способ заключается в смешивании галактозооксидазы, кремнезема, содержа„„SU„„1521775 А 1

2 логии, а именно к способам иммобилизации ферментов на неорганических носителях, и может быть использовано для определения галактозосодержащих углеводов в пищевой промышленности и медицине. Цель изобретения — упрощение способа и увеличение активности иммобилизованной галактозооксидазы, Способ заключается в смешивании буферного раствора галактозооксидазы с кремнеземом, содержащим аминопропильные группы, в присутствии 0,9-2,88 r галактозы íà I r носителя. Вероятно, в этих условиях галактоза окисляется ферментом до 2,4-галактогексодиальдозы, которая и обеспечивает сшивку фермента с носителем. Положительный эффект достигается придобавлении 80- ур

115 ед активности фермента на 1 г носи- MФ ,теля. Использование способа упрощает С" процесс иммобилизации и увеличивет активность целевого продукта. t з.п. Я ф-лы. 1 табл.

С

b3

М а

«3

4 щего аминопропиловые группы и галак- р

В ° тозы при соотношении компонентов: на

1 r носителя 0,9-2,88 r галактозы и

80-120 международных единиц фермента.

После инкубации трех компонентов в буферном растворе в течение 2-х ч при комнатной температуре целевой продукт отмывали буфером от несвязывающегося белка. Вероятно, в этих условиях происходит превращение галактозы под действием фермента и 2,4-галактогексодиальдозу, которая выступает в роли сшивающего реагента и обеспечивает связы1521775 ванне фермента с аминокремнеземом. Полученные препараты обладают повышенной активностью, а сам способ значительно упрощается за счет проведения иммобилизации в одну стадию (вместо предварительной активации носителя и последующей иммобилизации), а также исключения стадии обработки хлористым циануром.

Л р и м е р 1. 1 r аминоорганокремнеэема инкубируют с 50 мл буферного раствора галактозооксидазы, содержащего 46 ед. активности, и с 50 мл буферного раствора галактозы, содержащего 0,36 г галактозы. Для i r носите" ля обычно готовят 100 мл смеси. Инкубацию проводят в течение 2 ч при комнатной температуре. Количество буферного раствора не имеет существенного значения., Декантацией раствор удаляют, 20 а после того носитель отмывают от несвязывающегося фермента небольшим количеством 0,05 М фосфатного буфера (рН 7,0). Активность иммобилиэованной галактозооксидазы определяют как описано ниже. Активность полученного иммобилизованного препарата составляет 9 ед/г носителя.

Пример ы 2 — 13. Все опрерации проводят в соответствии с предла- 30 гаемым способом иммобилизации галактоэооксидазы при соотношения компонентов, укаэанных. в таблице.

Иэ данных, приведенных в таблице, видно, что активность иммобилизованно-35 го препарата зависит от соотношения взятых компонентов. В результате взаимодействия носителя, галактозооксидазы и субстрата (галактозы), образуется иммобилиэованный фермент, так как 40 активность иммобилизованного фермента сохраняется в течение 2 мес в условиях проточного реактора (при пропускании 50 л буфера и 1000-кратного объема субстрата). Стабильность препара- 45 та не отличается от стабильности фермента, иммобилизованного ковалентно известным способом. Без добавления галактозы наблюдается десорбция фермента при промывании 2 объемами 0,05М50 фосфатного буфера (рН 7,0). Активность иммобилизованной галактозооксидазы определяют следующим образом. В термостатированную при 25ОС ячейку с кислородным электродом Кларка, содер- 55 жащую 5,5 мл 100 мМ раствора галактозы со 100 мкМ феррицианида калия и

1 мИ Na -ЭДТА в 0,05 M фосфатном буфере (рН 7,0), вносят 0,01 r иммобилиэованного фермента и регистрируют на ленте самописца кинетику потребления кислорода (1 ед.активности соответствует количеству фермента, катализирующего окисление 1 мкмоль субстрата эа 1 мин).

Анализ данных, приведенных в таблице,.показывает, что повышение активности наблюдается при добавлении

0,9-2,88 г галактозы на 1 г носителя °

Повышение концентрации галактозы до

3,24 r не приводит к увеличению активности целевого продукта, а снижение концентрации галактозы до 0,18 и

0,36 r вызывает уменьшение активности фермента. Увеличение активности иммобилизованной галактозооксидазы наблюдается при указанной концентрации галактозы и при добавлении 80115 ед активности фермента на 1 г носителя.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет упростить процесс получения иммобилизованной галактозооксидазы за счет исключения ряда стадий, а также увеличить активность целевого продукта от 59-75 до 75-89 ед.

1 г (в зависимости от количества использованного фермента).

eоpмУла изобретения

1.Способ получения иммобилизованной галактозооксидаэы, включающий взаимодействие галактозооксидаэы, кремнезема, содержащего на поверхности аминопропиловые группы, и вещества, инициирующего связывание фермента с кремнеземом, в буферном растворе и промывку препарата для удаления несвязывающегося фермента, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью упрощения способа и увеличения активности иммобилизованной галактозооксидазы, в качестве вещества инициирующего связывание фермента с кремнеземом, используют продукты превращения субстрата галактозооксидаэы — галактозы, устанавливая соотношение галактоза: кремнезем (0,9-2,88):1(по массе).

2. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что на 1 г кремнезема добавляют 80- 115 Е фермента.

1521775

Соотношение компонентов (на 1 г носителя) Активность иммобилизоПример

Галактозооксидаза исходная активность, ед/г

Галактоза, г/r ваного препарата, ед/г

П р и м е ч а н и е. По примереам 14-18 иммобилизация по известному способу.

Составитель В.Муронец

Редактор Н.Киштулинец Техред Л.Олийнык Корректор С.Черни

Заказ 6892/24 Тираж 501 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

1 0,36

2 2,88

3 0,18

4 3,24

5 1,44

6 0,9

7 0,9

8 0,9

9 0,9

10 0,9

11

12

13

14

16

17

46

46

46

46

46

23

12

23

69

23

12

9

4,5

38

89

89

12

4

21

69

12