Способ получения аристолохиевых кислот

Способ получения аристолохиевых кислот

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в химико-фармацевтической промышленности. Аристолохиевые кислоты, обладающие противоопухолевым действием, содержатся в растении кирказон маньчжурский. Целью изобретения является увеличение выхода целевого продукта и получение воспроизводимого источника сырья. Способ состоит в том, что для получения аристолохиевых кислот используют каллусы растения Aristolochia menshuriens, полученные при культивировании ткани на специально подобранных питательных средах при специфических условиях культивирования. 4 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в химико-фармацевтической промышленности. Аристолохиевые кислоты обладают противоопухолевым действием. Комплекс аристолохиевых кислот входит в состав растения кирказон маньчжурский Aristolochia manshuriensis Kom. Цель изобретения увеличение выхода целевого продукта и получение воспроизводимого источника сырья. Способ состоит в том, что для получения аристолохиевых кислот, продуцируемых растением Aristolochia manshuriensis, включающего экстрагирование их из сухого сырьевого материала, в качестве сухого материала используют каллусы Aristolocgia manshurinsis, которые индуцируют из эксплантатов интактного растения и культивируют первоначально на инициальной питательной среде следующего состава, мг/л воды: NH₄NO₃ 1145-1850 KNO₃ 1490-2100 CaCl₂ 2H₂O 420-500 MgSO₄ 7H₂O 350-400 KH₂PO4 150-210 Н₃БО₃ 4,2-8,0 MnSO₄ 4H₂O 15,6-26,7 ZnSO₄ 7H₂O 6,0-10,3 KI 0,53-0,90 Na₂MoO₄ 2H₂O 0,15-0,30 CoCl₂ 5H₂O 0,030-0,075 FeSO₄ 7H₂O 25,0-30,0 Na₂EDTA 2H₂O 26,1-40,1 CuSO₄ 5H₂O 0,030-0,075 Тиамина гидро- хлорид 0,15-0,25 Пиродоксина гидро- хлорид 0,40-0,60 Никотиновая кислота 0,40-0,60 Мезо-инозит 50,0-100,0 L-Цистеина гидро- хлорид 4,0-6,0 6-Бензиламино- пурин 0,2-1,0 Индолилуксусная кислота 1,0-3,0 Сахароза 2,5 10⁴-3,5 10⁴ Бакто-агар 5,5 10³-6,5 10³ при рН 5,2-6,2 с последующим отбором наиболее продуктивных каллусных линий, которые затем культивируют на продукционной питательной среде, активизирующей синтез аристолохиевых кислот следующего состава, мг/л воды: KNO₃ 1900-4400 CaCl₂ 2H₂O 110-1470 MgSO₄ 7H₂O 350-400 KH₂PO₄ 150-210 H₃BO₃ 4,2-8,0 MnSO₄ 4H₂O 15,6-26,7 ZnSO₄ 7H₂O 6,0-10,3 KI 0,53-0,90 Na₄MoO₄ 2H₂O 0,15-0,30 CuSO₄ 5H₂O 0,03-0,075 CuCl₂ 2H₂O 0,03-0,075 FeSO₄ 7H₂O 25,0-30,0 Na₂EDTA 2H₂O 32,6-50,1 Тиамина гидро- хлорид 0,15-0,25 Пиридоксина гидро- хлорид 0,40-0,60 Никотиновая кислота 0,40-0,60 Мезо-инозит 50,0-100,0 L-Цистеина гидро- хлорид 4,0-6,0 6-Бензиламино- пурин 1,0-5,0 Индолилуксусная кислота 0,5-1,0 Сахароза 3,5 10⁴-4,5 10⁴ Бакто-агар 5,5 10³-6,5 10³ при рН 5,6-5,8. Инициальная среда составлена на основе прописи Мурасиге и Скуга с необходимыми изменениями. В табл.1 приведены составы сред Мурасиге-Скуга и инициальной. При инкубации эксплантатов А.manshuriensis на среде Мурасиге-Скуга получаются первичные слабые каллусы, которые некротизируют при пересадке. После изучения каждого компонента питательной среды по отдельности, испытывая в каждом опыте его развертку (макро- и микросоли оставлены по прописи Мурасиге-Скуга), получили указанные выше среды. Приведены прописи сред с минимальными, средними и максимальными содержаниями ингредиентов. Эти содержания соответствуют концентрации веществ в интервале их оптимального действия. В табл.2 приведены основные изменения по сравнению с первоначальной средой Мурасиге-Скуга и причины, по которым эти изменения были сделаны. Продукционная среда разработана на основе инициальной и модифицирована для синтеза аристолохиевых кислот. При разработке продукционной среды каждый ингредиент испытывался отдельно, при этом определялась его лучшая концентрация. Затем выяснялись взаимодействия компонентов среды путем постановки полных факторных экспериментов ПФЭ 2⁴. На основе этих опытов среды оптимизировались. Ниже приведены следующие основные отличия продукционной среды от инициальной. Исключен нитрат аммония, так как это вещество ингибирует синтез апристолохиевых кислот, нитрат калия вносится в концентрации 1900-4400 мг/л; хлористый кальций вносится в концентрации 110-1470 мг/л; комплекс железо ЭДТА дается в молярном соотношении 1:1,25, а не 1:1 (как в инициальной среде) для предупреждения выпадения осадка фосфата железа, количество 6-бензиламинопурина увеличено до 1-5 мг/л, а индолилуксусной кислоты снижено до 0,5-1,0 мг/л, количество сахарозы увеличено до 35-45 г/л. П р и м е р ы 1-3. Однолетние побеги дикорастущей лианы кирказона маньчжурского, собранные в июне 1986 года в Надеждинском районе Приморского края, стерилизуют в 0,2%-ном растворе диоцида (этанолмеркурия хлорид и цетилпиридиния хлорид) в течение 8 мин. После трехкратного отмывания в стерильной дистиллированной воде из побегов вычленяют эксплантаты диаметром 4-5 и толщиной 2-3 мм. Эксплантаты помещают в пробирки 200 х 20 мм, содержащие по 20 мл инициальной среды с минимальными, средними и максимальными значениями ингредиентов, по 10 эксплантатов на каждый вариант среды. Используются питательные среды указанного выше состава. Через 10 дней культивирования в темноте при 25^оС и относительной влажности воздуха 70% из эксплантатов образуется по 7 первичных каллусов на каждой среде (количество образующихся каллусов составляет 70 + 10% от числа эксплантатов). Через месяц со дня посадки каллусы отделяют от эксплантата и среды инициации и пассируют на свежие питательные среды такого же состава для получения устойчивых каллусных линий и достижения необходимого масштаба и размножения каллусов. Полученные каллусные линии содержат 0,03 0,01% аристолохиевых кислот от сухой массы. Затем активируют синтез аристолохиевых кислот путем культивирования полученных каллусов на продукционной среде, также выполненной в трех вариантах с минимальным, средним и максимальным значениями ингредиентов. Для этого каллусы разрезают в стерильных условиях на инокуляты размером 4 х 4 х 5 мм, что соответствует начальной массе 80 мг. Полученные инокуляты помещают в пробирки 200 х 20 мм, содержащие по 20 мл продукционной среды с минимальными, средними и максимальными значениями ингредиентов, по 20 инокулятов на каждый вариант. Используют питательные среды указанного выше состава. Культуры инкубируют в климатической камере при 25^оС и относительной влажности воздуха 70% в темноте в течение 7 недель, за это время в каллусах накапливается максимальное количество аристолохиевых кислот (1 1,2 мг на каллус). По истечении периода культивирования каллусы извлекают из культуральных сосудов, высушивают при 60^оС в течение 24 ч и взвешивают. Получают 5,0 г сухих каллусов со среды, имеющей средние значения ингредиентов. Эти каллусы измельчают до размера частиц 1-2 мм и экстрагируют трехкратно по 50 мл метиловым спиртом в течение 9 дней, по три дня каждая экстракция. Извлечения объединяют и после фильтрации отгоняют растворитель при пониженном давлении, используя ротационный испаритель. Получают густой коричневый сироп, который растворяют в 150 мл бутилового спирта. Полученный раствор экстрагируют пятикратно по 50 мл насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия. Объединенные щелочные извлечения подкисляют до рН 7 5%-ным раствором соляной кислоты и вновь экстрагируют тремя порциями по 50 мл бутилового спирта. Экстракты выпаривают под вакуумом досуха и получают 27,5 мг аристолохиевых кислот. Подобным образом проводят выделение аристолохиевых кислот из каллусов, выращенных на средах, имеющих минимальные и максимальные содержания ингредиентов. В табл.3 представлены результаты получения аристолохиевых кислот по известному и данному способам. Таким образом, предлагаемый способ позволяет увеличить выход аристолохиевых кислот. Преимущество предлагаемого способа состоит в том, что он позволяет получить постоянно воспроизводимый источник сырья для выработки аристолохиевых кислот, а также открывает возможность повышать содержание целевого продукта относительно интактного растения путем селекции продуктивных каллусных линий. Кроме того, использование предлагаемого способа позволит избежать уничтожения редкого растения Arictolochia manshuriensis при использовании его в качестве сырья. Работы по получению культуры каллусов Aristolochia manshuriensis начались в марте 1986 года. Материал части растения Aristolochia manshuriensis заготавливался в следующих местах: Надеждинский район Приморского края, река Нежинка, 22 км западнее села Нежино; Уссурийский район Приморского края, Горно-таежная станция ДВО АН СССР; Приморский край, г.Владивосток, Ботанический сад ДВО АН СССР. Материал заготавливался ежемесячно в течение полутора лет. Часть его использовалась для получения каллусов, другая часть для химического анализа и фармакологических испытаний. В течение полутора лет проводились опыты по получению каллусов, в результате которых выявлена сезонная динамика каллусообразования. Каждая каллусная линия анализировалась на содержание аристолохиевых кислот. Анализ содержания аристолохиевых кислот проводился в Биолого-почвенном институте и параллельно в Тихоокеанском институте Биоорганической химии. Результаты количественных определений содержания аристолохиевых кислот в тканях интактных растений и в каллусах представлены в табл.4. Отмечается высокая стабильность содержания аристолохиевых кислот в интактных дикорастущих растениях. Так, их содержание в растениях из Надеждинского района составляет 0,29-0,36% из Уссурийского района 0,29-0,34% из пригорода Владивостока 0,28-0,36% Растения в январе содержат 0,32-0,34% аристолохиевых кислот, в апреле 0,34-0,36% в июле 0,29-0,30% а в октябре 0,28-0,31% Во всех каллусных культурах также накапливается примерно одинаковое количество аристолохиевых кислот. Содержание их в каллусах, полученных от растений из Надеждинского района, составляет 0,52-0,66% из Уссурийского района 0,46-0,69% из пригорода Владивостока 0,45-0,61% Каллусы из растений, собранных в январе, содержат 0,46-0,52% аристолохиевых кислот, в апреле 0,53-0,66% в июле 0,45-0,69% в октябре 0,40-0,66% Таким образом, приведенные результаты количественного определения содержания аристолохиевых кислот в тканях интактных растений, заготовленных в различное время года и в различных местах, и в каллусных тканях, полученных из этих растений, показывают, что из содержащих примерно равные количества аристолохиевых кислот дикорастущих растений получаются каллусы, также содержащие примерно одинаковые количества аристолохиевых кислот.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АРИСТОЛОХИЕВЫХ КИСЛОТ, включающий экстрагирование их растворителем из растительного сырья, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта и получения воспроизводимого источника сырья, в качестве растительного сырья используют каллусы Aristolochia manshuriensis, которые индукцируют из эксплантатов интактного растения и культивируют первоначально на инициальной питательной среде следующего состава, мг/л воды: NH₄NO₃ 1145 1850 KNO₃ 1490 2100 CaCl₂ 2H₂O 420 500 CuSO₄ 5H₂O 0,030 0,075 MgSO₄ 7H₂O 350 400 KH₂PO₄ 150 210 H₃BO₃ 4,2 8,0 MnSO₄ 4H₂O 15,6 26,7 ZnSO₄ 7H₂O 6,0 10,3 KI 0,53 0,90 Na₂MoO₄ 2H₂O 0,15 0,30 CoCl₂ 5H₂O 0,030 0,075 FeSO₄ 7H₂O 25 30 Na₂EDTA 2H₂O 26,1 40,1 Тиамина гидрохлорид 0,15 0,25 Пиридоксина гидрохлорид 0,4 0,6 Никотиновая кислота 0,4 0,6 Мезоинозит 50 100 L-цистеина гидрохлорид 4 6 6-Бензиламинопурин 0,2 1,0 Индолилуксусная кислота 1 3 Сахароза 2,5 10⁴ 3,5 10⁴ Бакто-агар 5,5 10³ 6,5 10³ при pH 5,2 6,2 с последующим отбором наиболее продуктивных каллусных линий, который затем культивируют на продукционной питательной среде, активизирующей синтез аристолохиевых кислот, следующего состава, мг/л воды: KNO₃ 1900 4400 CaCl₂ H₂O 110 1470 MgSO₄ 7H₂O 350 400 KH₂PO₄ 150 200 H₃BO₃ 4,2 8,0 MnSO₄ 4H₂O 15,6 26,7 ZnSO₄ 7H₂O 6,0 10,3 KI 0,53 0,90 Na₂MoO₄ 2H₂O 0,15 0,30 CuSO₄ 5H₂O 0,030 0,075 CaCl₂ 2H₂O 0,030 0,075 FeSO₄ 7H₂O 25 30 Na₂EDTA 2H₂O 32,6 50,1 Тиамина гидрохлорид 0,15 0,25 Пиридоксина гидрохлорид 0,4 0,6 Никотиновая кислота 0,4 0,6 Мезо-инозит 50 100 L-цистеина гидрохлорид 4 6 6-Бензиламинопурин 1 5 Индолилуксусная кислота 0,5 1,0 Сахароза 3,5 10⁴ 4,5 10₄ Бакто-агар 5,5 10³ 6,5 10³ при pH 5,6 5,8.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4