Способ получения аллергена из пчелиного яда

Способ получения аллергена из пчелиного яда

Реферат

 

Изобретение относится к медицине, к способам получения аллергенов из пчелиного яда. Целью изобретения является повышение специфичности аллергена. Для достижения цели проводят выделение пчелиного яда и его обработку, причем выделение яда осуществляют путем электростимуляции пчел, сбора яда и его высушивания, а обработку высушенного яда проводят путем растворения его в воде, добавления альбумина в концентрации 0,03 - 0,033% с последующей инкубацией смеси в течение 18 - 20 ч при 3 - 5^oС, затем центрифируют и диализуют при 3-5^oС.

Изобретение относится к способам получения аллергена для снижения чувствительности к пчелиному яду. Целью изобретения является повышение специфичности аллергена. П р и м е р 1. Сырьем является пчелиный яд, полученный от пчел Apis mellifera методом электростимуляции или ручным способом. Свежедобытый пчелиный яд представляет собой прозрачную, слегка желтоватую жидкость с острым горьким вкусом и сильным ароматическим запахом. Плотность яда 1,1313 г/см³. Яд содержит приблизительно 40% сухого остатка и на воздухе быстро затвердевает. Пчелиный яд обладает высокой аллергенной активностью, основными аллергенами являются: фосфолипаза А, мелиттин, гиалуронидаза, кислая фосфатаза, антиген С. Приготовляют навеску сухого пчелиного яда, полученного известным методом электростимуляции 146 мг и растворяют в 90 мл дистиллированной воды. Опытным путем установлено, что данное соотношение яда и воды дает в конечном продукте содержание белка 1 мг/мл. В раствор добавляют 27 мг сухого плацентарного альбумина человека (из расчета его концентрации в растворе 0,03-0,33% ) в качестве сорбента для увеличения стабильности иммуноактивных компонентов яда и растворяют его. Инкубируют раствор с альбумином в течение 18 ч в холодильнике при температуре 3^оС. Очищают раствор от механических примесей путем центрифугирования в течение 10 мин при 6 000 об/мин. Для освобождения от низкомолекулярных компонентов проводят диализ надосадочной жидкости через целлофановую пленку "Диацелл" на магнитной мешалке в холодильнике при 3^оС в течение 30 мин при двукратной смене воды. Скорость вращения большого перемешивающего стержня (8х35 мм) 800 об/мин. Приготавливают растворы с конечными концентрациями белка в 1 мл раствора: 100;10; 1 и 0,1 мкг. Добавляют сахарозо-желатозную среду (не более 2%). Затем стерилизуют растворы аллергена под давлением через керамические стерилизующие свечи N 7 (вакуум 0,6-0,7 атм). Разливают растворы аллергена в ампулы по 1 мл и замораживают при -40^оС. Растворы лиофильно сушат в течение 48-50 ч (температура конденсации 60^оС). Ампулы запаивают. Для разведения аллергена готовят разводящую альбуминовую жидкость, получаемую на основе тест-контрольной жидкости с содержанием 0,3 мг альбумина в 1 мл. Полученный аллерген представляет собой порошок белого цвета, имеет влажность 1-3% способен растворяться в разводящей альбуминовой жидкости без осадка. Препарат стерилен, не обладает токсическими свойствами и, следовательно, безвреден. Специфическую активность аллергена определяли методом общей анафилаксии. Результаты опытов показали, что аллерген обладает специфическими антифилактогенными свойствами. Анафилактический индекс составил 2-3,7. П р и м е р 2. Препарат получают описанным способом, при этом инкубирование раствора с альбумином проводят в течение 20 ч в холодильнике при 5^оС, а центрифугируют раствор в течение 8 мин при 6000 об/мин. Проверяют аллерген на специфическую активность методом пассивной кожной анафилаксии. Результаты опытов показали, что аллерген обладает высокой специфической активностью. Установлено, что при введении морским свинкам аллергена в дозе 200 мкг белка у животных вырабатываются гомоцитотропные антитела. Титр по площади посинения составляет 1:512-1024. Сенсибилизация морских свинок аллергеном из яда пчел в дозе 200 мкг белка дает более высокий титр по площади посинения по сравнению с аллергеном из тела пчел, использованным в дозе, превосходящей сенсибилизирующую дозу аллергена из яда пчел. Полученный предлагаемым способом препарат содержит иммунологически активные компоненты яда (что показала проверка на гемолитическую и фосфолипазную активность). Таким образом, новый препарат содержит именно те компоненты, которые человек получает при сенсибилизации пчелиным ядом, поэтому этот препарат позволяет эффективно снизить чувствительность к пчелиному яду (так как препарат должен содержать именно те компоненты, к которым организм имеет повышенную чувствительность). Технология изготовления аллергена позволяет освободиться от балластных низкомолекулярных (иммунологически неактивных) компонентов яда без потери активности иммунологически активных компонентов. Очистка препарата (диализ и центрифугирование) осуществляется после того, как биологически активные компоненты яда связаны с альбумином и при низкой температуре 3-5^оС, что обеспечивает хорошую их сохранность при дальнейшей обработке препарата. Ненужные (балластные) вещества при диализе выходят через пленку в воде. Механические примеси отделяют от раствора центрифугированием и осадок выбрасывают. Известно, что водные растворы пчелиного яда нестойки и если бы обработка шла без альбумина и при более высокой температуре, то все биологически активные компоненты яда разрушились бы. Разработанный способ позволяет легко дозировать содержание пчелиного яда в препарате в отличие от известного способа, в котором невозможно было точно установить количество яда в экстракте. Лиофилизация и приготовление препарата в сухом виде обеспечивает лучшую его сохранность по сравнению с прототипом (жидкий препарат). Можно на всех стадиях приготовления аллергена контролировать содержание биологически активных компонентов в препарате (с помощью фосфолипазного и гемолитического методов).

Формула изобретения

Способ получения аллергена из пчелиного яда, включающий выделение пчелиного яда и его обработку, отличающийся тем, что, с целью повышения специфичности аллергена, выделение яда проводят путем электростимуляции пчел, сбора яда и его высушивания, а обработку высушенного яда проводят путем растворения его в воде, добавления альбумина в концентрации 0,03 0,33% с последующей инкубацией смеси в течение 18 20 ч при 3 5^oС, затем центрифугируют и диализуют при 3 5^oС.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Номер и год публикации бюллетеня: 36-2000

Извещение опубликовано: 27.12.2000