Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus, используемый для получения моноклональных антител к @ - тимозину

Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus, используемый для получения моноклональных антител к @ - тимозину

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к гибридной технологии и может быть использовано при получении диагностикума. Цель изобретения - создание нового штамма гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела (монАТ) класса JGM. Депонирован под номером ВСКК(П) N 115Д. Штамм получен путем слияния клеток миеломы SP2/0 с клетками селезенки мыши BALB/с, иммунизированный конъюгатом бычий сывороточный альбумин-α<SB POS="POST">1</SB>-тимозин. При культивировании IN VITRO штамм образует круглые клетки, слабо прикрепляющиеся к твердой подложке. Время удвоения популяции 30 ч. Клетки культивируют на среде RPM1-1640 с добавлением 10% летательной бычьей сыворотки, глютамина и меркаптоэтанола. Прививка клеток гибридомы сингенным мышам вызывает образование асцитной опухоли. Продуцируемые штаммом монАТ относятся к классу JGM и специфически связываются с α<SB POS="POST">1</SB>-тимозином. Конъюгация монАТ с биотином не сопровождается существенным снижением их активности, что дает основание для их использования в высокочувствительных вариантах иммунологического определения α<SB POS="POST">1</SB>-тимозина.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧ ЕСНИ Х

РЕСПУБЛИК („) SU(») 15 2 (11 4 С 12 N 5/00, А 61 K 39/395

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4405473/31-13 (22) 10.02.88 (46) 07 ° 12.89. Бюл . М 45 (71) Институт цитологии, Ленинградский научно-исследовательский институт детских инфекций, Всесоюзный научно-исследовательский институт технологии гормональных препаратов и кровезаменителей и Ленинградский государственный университет (72) Б.В. Попов, И.А. Попова, В.А. Лившиц, О.Ф. Салова, В.Н.Калихевич и 3.А.Ардемасова (53) 578.085.23(088.8) (56) I.Е. Meclure et al. m. J.Immunology, 1982, ч. 128, р. 368 -371.

К.К. Oates et al ш. Hybridoma, 1984, v. 3, р.100. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЪТИВИРУЕ14ЫХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ М11Е MUSCULUS ИСПОЛЪЗУЕИЫИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ 11ОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К О, -ТИМОЗИНУ (57) Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано при получении диагностикума. Цель изобретения — создание

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для конструирования диагностикума для определения Ы,-тимозина у человека и животных.

Цель изобретения — создание нового штамма гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела класса IgN.

Штамм получен при слиянии клеток миеломы, Sp 2/О со спленоцитами нового штамма гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела (монАТ) класса IgN. Депонирован под номером BCKK(II) N - 115Д. Штамм получен путем слияния клеток миеломы

Sp 2/О с клетками селезенки мьппи

BALB/с, иммунизированной коньюгатом бычий сывороточный альбумин — Ы,-тимозин. При культивировании in vitro штамм образует круглые клетки, слабо прикрепляющиеся к твердой подложке.

Время удвоения популяции 30 ч. Клетки культивируют на среде RPNI-1640 с добавлением 107 летальной бычьей сыворотки, глютамина и меркаптоэтанола.

Прививка клеток гибридомы сингенным мышам вызывает образование асцитной опухоли. Продуцируемые штаммом монАТ относятся к классу IgN и специфически связываются с оС -тю оэином. Коньюгация монАТ с биотином не сопровождается существенным снижением их активности, что дает основание для их использования в высокочувствительных вариантах иммунологического определенияо,-тимозина.

Ю мьппей BALB/с, иммунизированных оС,— тимо з ином, С целью индукции иммунного ответа к п, -тимозину готовят конъюгат o(.i— тимозин — бычий сывороточный альбумин (БСА). Для этого препарат, содержащий не менее 10Х чистого о, тимозина, конъюгируют с бычьим сывороточньпч альбумином. С этой целью

БСА сукцинипируют, затем получают

N-оксисукцинимидный эфир БСА, кото1527260

35 рый конъюгируют с пептидным материалом, содержащим о,-тимоэин. Для иммунизации животных конъюгат о4 тимозин — ВСА растворяют в фосфатном

5 буфере с рН 7,4 и смешивают в соотношении 1:1 с полным адъювантом

Фрейнда. Полученную счспензию вводят внутрикожно мьппам в б точек тела иэ расчета по 100 мкг о, -тимозина на одну мьппь. Последующие 8 инъекций делают с недельным интервалом. Вторая инъекция идентична первой, начиная с третьей животным вводят иммуноген беэ адъюванта Фрейнда. Спустя

4 и 8 недель после начала иммунизации у мышей берут кровь из ретроорбитального синуса с целью определения силы иммунного ответа иммуноферментным методом. Затем наиболее силь- 20 но отвечающую мышь забивают, стерильно готовят суспензию клеток селезенки. Полученные спленоциты сливают с клетками миеломы с помощью полиэтиленгликоля 4000.

Скрининг гибридом проводят с помощью твердофазного иммуноферментного анализа. Высокоочищенный природный или синтетический оС -тимозин растворяют в карбонатном буфере с рН 9,6 в концентрации 10 мкг/мл и наносят по 100 мкл в ячейку 96-луночной плоскодонной коммерческой пластины. Контрольным антигеном служит бычий сывороточный альбумин в той же концентрации. Пластины инкубируют 18 ч при 4 С. Затем ячейки той же концентрации. Пластины инкубируют 13 ч и ри 4 С. Затем ячейки отмывают от несвяэавшегося антигена фосфатным 40 буфером с рН 7,4, содержащим 0,053

Твин 20. Следующими слоями иммунного сендвича служат супернатанты гибридов и кроличьи аффинные антитела к иммуноглобулинам мьппи, конъюгирован- 45 ные с пероксидазой хрена. В качестве субстрата пероксидазы используют перекись водорода, хромогеном служит ортофенилендиамин. Реакцию оценивают на мультискане при длине волны 450 нм 50

Полученный позитивный клон дважды клонирован методом лимитирующих разведений, в результате чего отобран штамм альфа-1/36/4, стабильно продуцирующий монАТ к о, -тимозину. Штамм клонирован в брюшной полости мьппей с целью наработки антител.

Штамм хранится в специализированной коллекции клеточных культур Института цитологии АН СССР под номером BCKK(II) М 115 Д и характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Культура состоит из клеток округлой формы диаметром 29-30 мк,большую часть

I клеток занимает ядро с 1-3 плотными ядрьппками, клетки располагаются раздельно при низкой плотности и образуют кластеры при увеличении их числа до 2 ° 10 мл и вьппе.

Культуральные признаки.

Стандартные условия культивирования - ростовая среда ДМЕ или RPNI

1640 с добавлением 0,05 мм меркаптоэтанола, 14.,7 мг/л глютамина, 10Х эмбриональной телячьей сыворотки.

Культивирование проводят в пластио ковой или стеклянной посуде при 37 С

В пластиковый флакон емкостью 50 мл при 5Х СО помещают 1 10 клеток в

5-7 мл культуральной среды. Исходное количество клеток в том же объеме среды без поддержания постоянства газового состава должно быть в 10 раз больше. При росте в указанных условиях штамм образует круглые клетки, слабо прикрепляющиеся к твердой подложке и снимающиеся с нее ресуспендированием супернатантом. Время удвоения популяции 30 ч. Кратность рассева 1:3 3-4 раза в неделю.

Культивирование в организме животных. Внутрибрюшинное введение клеток сингенным мышам, сенсибилиэированным пристаном илн вазелиновым маслом, вызывает образование асцитной опухоли. В сыворотке крови и асците таких животных содержатся антитела к аС -тимоэину. Способность к продукции монАТ сохраняется при последовательных перевивках клеток от одного животного другому, а также лри культивировании клеток асцитической жидкости in vitro

Продуктивность штамма.

При стандартных условиях культивирования ln vitro гибридома продуцирует 10-20 мкг/мл антител при плотности клеток 0,5-.1,0 10 на 1 мл.

При культивировании in vivo от одной мьппи можно получить однократно

0,5-0,6 мл сыворотки и 1-3 мл асцита, в которых содержится 20-40 мг антител.

Характеристика полученного продукта. МонАТ, продуцируемые гибридомой, связываются с высокоочищенным

5 15 природным ь <-тимозином из тимуса крупного рогатого скота и синтетическим оС<-тимозином. Методом ДСН-электрофореза установлено, что штамм

115 Д продуцирет IgN цепь иммуноглобулинов. Принадлежность антител штамма к классу IgN подтверждено путем иммуноферментного анализа с использованием коммерческих антител к

М цепям иммуноглобулинов. Стабильность продуцирования в культуре не менее 30 пассажей.

Криоконсервирование. Криоконсервацию проводят в ростовой среде с добавлением 10Х диметипсульфоксида при концентрации клеток 1-10 10 на

1 мп. Жизнеспособность клеток после размораживания 70Х.

Контаминация. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены, тест на микоплазму отрицателен.

Пример 1. По 3 10 клеток вводят внутрибрюшинно мышам ВАЬВ/с.

На 14-й день после введения у каждой мыши берут по 1,5 мл асцитической жидкости и пд 1,0 мп крови. Взятый материал пулируют и после свертывания крови и ретракции сгустка. центрифугируют при 4000 об/мин 30 мин. Иммуноглобулины супернатанта трижды осаждают 40Х-ным сульфатом аммония, растворяя осадок в 0,1 М фосфатном буфере с рН 7,4. После окончания обработки получают 4,0 мл раствора, содержание белка в котором по данным спектрофотометрии при 280 нм составляет 30 мг/мл. При электрофорезе в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-электрофорез) в полученном материале установлено наличие несвойственной препаратам нормальной сыворотки мышей полосы в зоне мол.м 70 кДа, величина которой составляет не менее 50Х величины всех белков данной дорожки и представляет собой тяжелые цепи иммуноглобулинов, синтеэируемые штаммом гибридом 115 Д. Таким образом, примерное содержание монАТ в полученном препарате составляет 60 мг, а количество антител, продуцируемое одной мышью, 30 мг. Учитывая молекулярную массу тяжелой цепи монАТ, их следует отнести к иммуноглобулинам класса М.

Полученные антитела испытывают в иммуноферментном анализе, нанося белок в количестве 5 мкг/мл на твердую фазу

27260 6

55 с фиксированным оС -тимозином. СпециI фичность антител выявляют, нанося в качестве третьего слоя аффинные кроличьи антитела к иммуноглобулинам мышии, конъюгированиые с пероксидазой хрена. В другом варианте опыта реакцию заканчивают нанесением аффинных кроличьих антител к иммуноглобулинам мьппи, пероксидазы хрена и моноклональных антител к пероксидаэе хрена, т.е. комплекса пероксидаэа — антипероксидаза. В обоих вариантах опыта получено специфическое связывание моиАТ с М, -тимоэином, но не с БСА.

Пример 2. Двум мышам BALB/с, предварительно сенсибилизированным ваэелиновым маслом, трансплантируют внутрибрюшинно 1 10 клеток штамма

115 Д. На 6-.е сутки от одной из опытных мьппей получают 3,0 мл асцитической жидкости и 1,0 мл крови, от другой — по 1,0 мл асцита и крови.

Клетки асцитической жидкости осаждают центрифугированием, ресуспендируют в О,1 М и фосфатном буфере

Ы и вводят повторно по 3 ° .10 двум сенсибипиэированным вазелиновым маслом мышам BALB/с. На 10-е сутки после переноса у вторичных реципиентов берут по 1,5 мл асцита и по 1,0 мл крови. После стандартной обработки сульфатом аммония получено 150 мг белка, который переводят в 0,1 М фосфатный буфер с рН 7,4 с помощью сефадекса G-25, а затем биотинилируют.

Полученные препараты проверяют на специфичность связывания с оС тимозином с помощью двух вариантов иммуноферментного метода. В первом варианте на о 1 -тимозин и БСА, фик— сировчнные на твердой фазе, наносят биотинилированные монАТ в концентрации 0,05 мкг/мл и авидин, конъюгированный с пероксидаэой хрена. Во втором варианте на твердую фазу наносят аффинные кроличьи антитела к иммуноглобулинам G мышии, затем сыворотку мьппи, спленоциты которой использовали для полуяеыия штамма. Следующие слои иммунного сендвича — это специфический и контрольный антиген, испытуемые биотинилированные антитела и конъюгат авидин — пероксидаза. В обоих вариантах опыта получено специфическое связывание биотинипированных антител с о, -тимозином,но не с БСА.

1527260

Формула изобретения

Составитель Г. Смирнова

Редактор О. Юрковецкая . Техред М.Дидык Корректор О.Бипле

Заказ 7481/34 Тираж 501 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г,ужгород, ул. Гагарина,101

Таким образом, штамм 115 Д дает возможность получать монАТ к Ы<-тимозину с последующим их использованием с целью определения о<.<-тимозина в различных вариантах иммуноферментного анализа.

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Nus musculus BCKK(II)

Р 115 Д, используемый для получения моноклональных антител к < -тимозину.