Способ определения нейтрофилов, несущих f @ -рецепторы

Способ определения нейтрофилов, несущих f @ -рецепторы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения наличия FC - рецепторов на нейтрофилах и оценки состояния противоинфекционного иммунитета. Целью изобретения является повышение достоверности способа за счет стабилизации тест-системы. Проводят обработку растворов JGG - носителя, инкубацию носителя с нейтрофилам с последующим определением клеток, несущих F<SB POS="POST">C</SB> - рецепторы, по их разнице в опытной и контрольной пробы, причем JGG предварительно агрегируют, а в качестве носителя используют CNBR - активированную, а инкубацию проводят в течение 20-40 мин. 2 ил.

СОЮЗ СО8ЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (gl) 4 G 01 3 33/53

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4264813/28-14 (22) 19. 06. 87 (46) 15. 12 ° 89, Бюл. М 46 (71) Горьковский научно-исследовательский педиатрический институт и Горьковский медицинский институт им. С.M,Êèðoâà (72) А,Н,Р1аянский, И,В,Чеботарь, Е.Г.Зеленова и И,В,Горбунова (53) 612.438 (088 ° 8) (56) Авторское свидетельство СССР

Р 1158932, кл, G 01 N 33/54, 1983. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕЙТРОФИЛОВ, НЕСУЩИХ F -РЕЦЕПТОРЫ (57) Изобретение относится к медицине и может быть использовано для опИзобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для определения наличия

1" -рецепторов на нейтрофилах и оценки состояния противоинфекционного иммунитета.

Целью изобретения является повышение достоверности за счет стабилизации тест-системы, На фиг. 1 и 2 изображены графики, поясняющие предлагаемый способ, Поставленная цель достигается тем, что в известном способе определения

Р -рецепции нейтрофилов человека, включающем инкубацию нейтрофилов с

IgG-обработанным носителем используют CNBr — активированную сефарозу 4В, IgG агрегируют, а инкубацию нейтрофилов проводят в течение 20-40 мин при 36-37 С.

Предлагаемый способ отличается от известного тем, что в качестве но„„SU„„152912 А 1

2 ределения наличия F -рецепторов на с нейтрофилах и оценки состояния противоинфекционного иммунитета, Целью изобретения является повышение достоверности способа за счет стабилизации тест-системы, Для достижения цели проводят обработку растворов IgG-носителя, инкубацию носителя с нейтрофилами с последукипим определением клеток, несущих 1" -рецепторы, .по их разнице в опытной и контрольной пробах, причем ТдС предварительно агрегируют, а в качестве носителя используют

CNBr-активированную сефарозу, а инкубацию проводят в течение 20-40 мин.

2 ил ° сителя используют CNBr-активированную сефарозу 4В, IgG агрегируют, а инкубацию нейтрофилов проводят 2040 мин при 36-37 С.

Использование CNBr-активированной . сефарозы 4В в качестве носителя IgG позволяет стабилизировать тест-сис- © тему, так как активные грудпировки, CNBr способны к образованию ковален- © тной связи с белками, Использование . laaak других носителей (полистерен, мик- Я робные клетки) не обеспечивает образования ковалентной связи с IgG. Использование CgBr-активированной сефарозы 4В в качестве носителя IRG исключает процесс поглощения> так как размеры гранул сефарозы (60-120 мкм) делают CNBr-активированную сефарозу 48 недоступной поглощению нейтрофилами.

IgG агрегируют, так как посредством агрегации достигается изменение конформационной структуры иммуногло1529120 булина с переходом его Fr -фрагмента в положежле> наиболее оптимальное для взаимодействия с F ðåöåïòîðàìè клеток, что приводит к повышению стабиль5 ности тест-си стемы, Ннкубацию нейтрофилов проводя т 2040 мин, так как за это время адгезия нейтрофилов на гранулы IgG-связанной сефароэы 4В достигает максимума, затем начинает снижаться, На фиг, 1 показан выбор оптимального времени инкубации при взаимодействии нейтрофилов человека и IgG-связанной сефарозы 4В; по оси абцисс — время инкубации, по оси ординат — процент адгезированных нейтрофилов. Предлагаемые временные параметры являются оптимальными для стабилизации тест-системы (фиг. 1), ?О

Выбор температурных параметров (36о

37 С) обусловлен созданием наиболее физиологичных (температура человеческого тела) условий для функционирования нейтрофила и обусловлен экспериментально, На фиг. 2 показан процесс адгезии при различных температурных режимах (выше +37 С нейтрофил разрушается) и иллюстрирует максимальную,, адгезию при 36-37 С.

Предлагаемый способ определения F— с рецепции нейтрофилов человека имеет следующие преимущества перед известными: в предлагаемой тест-системе носительь ковал ентно связан с агр е гированным IgG, что делает систему стабильной (срок годности 12 месяцев и более); стабильность обеспечивает хорошую воспроизводимость определения нейтрофилов»

40 несущих Р -рецепторы> и дает возможность изучать F -рецепцию в динамике; данная тест-система позволяет целенаправленно выявить нейтрофилы, несущие

F -рецепторы, так как адгеэия нейтрос

45 филов в предлагаемом способе инициируется F -рецептораьы; предлагаемая с тест-система дает возможность получить объективные данные, так как IIQ предлагаемому способу исключается процесс поглощения нейтрофилами носителя IgG, Пример. Лммуноглобулин IgG по-. лучают из коммерческого иммуноглобулина методом хроматографии на диэтиламиноэтилтояполе-650 М ("ToyoSoda" > Япония) по методике Брок И, IgG агрегируют прогреванием при о

63 С в течение 30 мин. Агрегированный

IgG ковал ентно связывают с CNBr-активированной сефарозой 4В ("Pharmaoia", Лвеция), Для этого лиофилиэированную сефарозу 4В, активированную

CNBr регидратируют в 0,001 М растворе НС1 и промывают двумя литрами этого же раствора на пористом стеклянном фильтре, Затем на этом же . фильтре CNBr — активйрованную сефарозу

4В отмывают 200 мп связывающего буфера (О, 1 M раствор. МаСО > содержащий 0,5 М NaC1, рЧ 8,3), К промытому осадку сефарозы добавляют раствор агрегированного IgG (10 мг/мл) из расчета 10 мг на 1 мл геля, инкубируют

2 ч при комнатной температуре или 16ч при 4 C ° Переносят гель в буфер с агентом, блокирующим свободные активные группы CNBr (0,2 М раствор глицина, рН 8,0) и инкубируют 2 ч при комнатной температуре или 16 ч при

4 C. Удаляют недостаточную жидкость и отмывают осадок 200 мп О, 1 М раствора СН> СООМа > содержащим О, 5 М NaC1, 3 атем отмывают 200 мл связывающего буфера (О,1 M раствор NaCO > содержащий 0,5 М ИаС1> рН 8,3) и дважды отмывают (по 50 мл) раствором Хенкса, Сефароза 4В, ковалентно связанная с агрегированным IgG готова к употребо лению, Хранят при 4 С, Нейтрофилы выделяют из крови здоровых людей в двойном градиенте плотности фиколл-верографин (1 > 116 и 1,077 г/см ), взвешиЭ вают в растворе Хенкса в концентрации 5 млн, клеток/мл. Смешивают в равных объемах (по 0,2 мл) нейтрофилы (концентрации 5 млн, клеток/мп) и взвесь IgG-связанной сефарозы (концентрация 20000 гранул/мп), инкубируют 20-40 мин при 36-37 С. Контролем служит реакция с сефароэой, не связанной с IgG. После инкубации сефарозы с нейтрофилами в каждую пробирку заливают по 1 мп раствора Хенкса. Через 3 мин, когда гранулы сефарозы осядут на дно пробирки, подсчитывают число клеток в супернатанте с помощью камеры Горяева, Подсчет клеток для опытной (с IgG-связанной сефарозой) и контрольной (с сефарозой, не связанной с IgG) проб ведется по всей камере Горяева (в 225 квадратах), Показатель Гс -рецепции нейтрофилов(Р -IIPH) с процент нейтрофилов, содержащих рецепторы к F -фрагменту, выражается пр следующей формуле, опыт

I - ПГН-100-(— — — — 100), с контр ол ь

20 6 методике фирмы-изготовителя ("Fharmaciaв Швеция).

Взвесь нейтрофилов с IgG-связанной сефарозой инкубировали в равных объемах (по 0,2 мл) 30 мин при 37 С (концентрация нейтрофилов 5 млн/мл; концейтрация сефарозы 20000 гранул/мл), В контроле использовали сефарозу, не связанную с IgG, После инкубации в каждую пробирку добавляли по 1 мл раствора Хенкса. Затем в камере Горяева подсчитывали количество клеток из надосадка в опыте и в контроле: опыт

90 -иейтрофилов; контроль — 150 нейтрофилов, Способ определения нейтрофилов, несущих Рс -рецепторы, включающий обработку растворов IяЫ-носителя, инкубацию носителя с нейтрофилами с последу;ощим определением клеток, несущих

Р -рецепторы, по их разнице в опытной и контрольной проРах, о т л и ч а ю шийся тем, что, с целью повьпдения достоверности способа за счет стабилизации тест-системы, IgG предварительно агрегируют, в качестве носителя используют С1П)г-активированную сефарозу, а инкубацию проводят в течение 20-40 мин, 5 15291 где опыт — количество нейтрофилов, поц-, 1 считанных в 225 квадратах камеры Горяе- ва, в опытной пробе; контроль — количество нейтрофилов, подсчитанных в .

225 квадратах камеры Горяева, в контрольной пробе, В опыте нейтрофилы активнее присоединяются к IgG-связанной сефарозе, поэтому в надосадке их содержится меньще по сравнению с контролем. Разделив количество нейтрофилов из надосадка в опыте на количество нейтрофи-. лов из надосадка в контроле и умножив на 100, получают процент клеток, оставт5 щихся в надосадке. Следовательно, оставшиеся клетки (от 100% вычесть процент клеток в надосадке) присоединились к IgG-связанной сефарозе — это и есть процент клеток, содержащих ре- 20 цептуры к F -фрагменту иммуноглобулис нов IgG, Проведена оценка F -рецепторов нейС трофилов у исследуемого донора Мастеровенко С.А., 22 лет. 25 .

В стерильных условиях из вены получено 3,0 мл крови, Нейтрофилы выделяли путем центрифугирования в двухступенчатом градиенте плотности (1,116 и 1,077 г/см j фиколл-верографин, Поо- 30

Ле двухкратного отмывания физиологическим раствором (общий объем 20 мл) нейтрофилы ресуспендировали в растворе Хенкса, Конечная концентрация нейтрофилов — 5 млн, клеток/мл. Все манипуляции прбводили в силиконирован— ной посуде.

CNBr-активированную сефарозу 4В рязывали с агрегированным IgG no

F -ПРН=)00-(--- ) 00) =100-60=40%.

l50

У исследуемого донора показатель

F -рецепции нейтрофилов равен 40%, т,е.

40% нейтрофилов содержат рецепторы к

F -фрагменту IgG.

Формул а изобретения!

529120

< 2РС

4 Р емжраеура

Я0г я

Составитель А,Макаров

Техред М.Дидык

Корректор H.Êîðîëü

Редактор Т, Парфелова

Заказ 7634/39 Тирам 789 Подпи с ное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открьггиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул. Гагарина, 101