1530101 - Способ получения амида

Способ получения амида

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в производстве амида микробиологическим способом. Цель изобретения - ускорение способа. Амид получают путем гидратации нитрильного соединения с помощью суспензии грамположительных микроорганизмов при 0-20°С и PH среды 6-9, при этом суспензию предварительно облучают светом либо процесс гидратации ведут при освещении, либо осуществляют предварительную обработку светом суспензии и производят таковую по ходу реакции. Для этого используют световую энергию в количестве не менее 1<SP POS="POST">.</SP>10<SP POS="POST">-2</SP> мкЕ/г клеток в 1 с. с длиной волны 200-800 нм. Реакцию гидратации проводят в сосуде, состоящем по меньшей мере частично из материала, не пропускающего свет. 3 з.п.ф-лы, 6 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК вЂ” вЂ” «»

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ б (;

° - /Я

К IlATEHTV

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 3764662/28-13 (22) 11.06.84 (31) 125588/1983 (32) 12.07.83 (33) 1Р (46) 15.12,89. Бюл. Н" 46 (71) Нитто Кагаку Когио Кабусики Кайся и Мицубиси Рэйон КО, Лтд (Л ) (72) Есиаки Сатох, Ясутака Накасима, Конехико Еномото, Ацуси фудзивара и Тосиаки Дой (JP) (53) 66.095.115 (088.8) (56) Патент Японии 1Г 17918/81, кл. С 12 Р13/02,,1981.

Патент Японии К 38118/81, tm С 12 P 13/02, 1981 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АМИДА (57) Изобретение относится к биотех,нологии и может быть использовано в

Изобретение относится к области биотехнологии и, может быть использовано в производстве амида микробиологическим способом.

Цель изобретения - ускорение способа.

Пример 1. Промытые бактериальные клетки штамма N-774 (Corynebacterium) получают аэробным культивированием штамма в среде (рН 7,2), состоящей иэ глюкозы lь, пептона 0,53, дрожжевого экстракта 0,3ь, экстракта сусла 0,34 и сульфата железа (III) к

«7 Н О 0,05 ь, и промывкой полученных клеток фосфатным буфером 0,05 М, Клетки диспергируют s фосфатном буфере 0,05 М) рН 7,7 в темном месте с получением дисперсии клеток, имеющих (51)4 С 12 P 13/02 // С 12 Р 1/04

2 производстве амида микробиологическим способом. Цель изобретения - ускорение способа. Амид получают путем гидратации нитрильного соединения с помощью суспенэии грамположительных микроорганизмов при 0-20 С и рН среды

6-9, при этом суспензию предварительно облучают светом либо процесс гидратации ведут при освещении, либо осуществляют предварительную обработку светом суспенэии и производят таковую по ходу реакции, Для этого используют световую энергию в количестве не менее lк 10 2 мкЕ/г клеток в 1 с с длиной волны 200-800 нм. Реакцию гидратации проводят в сосуде, состоя- «щем по меньшей мере частично из матеЖ риала, не пропускающего свет. 3 э,п. ф-лы, 6 табл.

С: концентрацию 3,5 г высушенных клеток/

/л. Полученную суспенэию клеток делят на две асти. Одну из них оставляют при 0 С в течение 4 ч при облучении световой энергией 1,5 х 10 мкЕ/г кл. в с, используя два комплекта люминесцентных ламп дневного света длиной волны 400-800 нм мощностью по 4 Вт, и этот образец обозначен в дальнейшем как "выдержка на свету . Другую часть о оставляют при С С в темном месте в течение 4 ч> и этот образец в дальнейшем именуют как "выдержка в темноте".

При использовании каждой иэ клеточной суспензии иэ акрилонитрила получают акриламид и изучают скорость!

53о!о1 реакции с точки зрения количества получаемого таким путем акриламида.

В случае бактерий, выдерживаемых на свету, смесь 0,088 ч. клеток (здесь и ниже количество представляется массой сухих клеток), 1 ч. акрилонитрила и 98,9 12 ч. 0,05 M фосфатного буфера (рН 7,7) подвергают реагированию при 10 С в реакторе на 50 мл в течение 20 мин при перемешивании при описанных условиях, в дальнейшем эта реакция именуется ."реакция в условиях облучения". В случае бактерий, выдерживаемых в темноте, эту реакцию повторяют, но не обеспечивают освещения, и в дальнейшем эта реакция именуется

"реакцией в условиях темноты". После завершения реакции акриламид, содержащийся в каждом реакционном растворе, реакция в котором прекратилась, подвергают количественному анализу с помощью газовой хроматографии. В результате количество акриламила (АА) на единицу количества бактериальных клеток составило 41,1 мкмоль АА/мг кл. мин в реакции в условиях облучения и бактерий, выдерживаемых на свету, и 0,34 мкмоль АА/мг кл. мин в реакции в условиях темноты и бактерий, выдерживаемых в темноте. Отношение между этими показателями (т.е. реакция в условиях облучения и бактерий, выдерживаемых на свету / реакция в условиях темноты и бактерий, выдерживаемых в темноте) 121.

В примерах значение 41,4 мкмоль/hll кл. мин, полученное для реакции в условиях облучения и бактерий, выдерживаемых на свету, согласно примеру 1 указано относительным показателем

100 U. Таким образом, полученное в примере 1 значение для реакции в условиях темноты и бактерий, выдерживаемых в темноте,0,83 U.

Пример ы 2-13, Реакционный

45 раствор, имеющий состав. представленный в табл.1, получают с использованием бактериальных клеток, выдерживаемых на свету и отдельно вЂ” выдерживаемых в темноте, полученных в примере 1.

Реакционный раствор подвергают реагированию по методике примера 1. Соответствующие амидные соединения, содержащиеся в растворе после завершения реакции, подвергают количественному анализу с помощью газовой хроматографии с получением результатов, приведенных в табл.2.

Пример ы 14-18. Промытые бак1ериальные клетки получают приготовлением по методике примера 1 штаммов следующих родов: Bacillus (CBS494) в примере 14, Bacteridium (CBS496) в примере 15, ГIicrococcus (CBS497) в примере 16, Brevibact erium (CBS-717) в примере 17 и Nocard!.а (N-775) в примере 18. Промытые клетки обрабатывают по методике примера 1 с получением клеток, выдерживаемых на свету и соответственно в темноте.

При использовании клеток в следующем составе акриламид получают из акрилонитрила и скорость реакции изучают с 1очки зрения количества получаемого таким путем акриламида.

В случае штаммов, выдерживаемых на свету, смесь 0,088 ч. клеток, 1 ч. акрилонитрила и 98,912 ч. 0,05 М фосфатного буфера )рН 7,7) подвергают реагированию в течение 20 мин при

10 С в условиях перемешивания (реакция в условиях облучения), В случае штаммов, выдерживаемых в темноте, реакцию повторяют с тем отличием, что не производится освещения (реакция в темноте). Акриламид, содержащийся в каждом растворе после завершения реакции, подвергают количественному анализу с помощью газовой громатографии с получением результатов, приведенных в табл.3 (сравнительные данные по влиянию освещения на получение амидов).

Пример ы 19-21 и сравнительные примеры 1 и 2. Промытые бактериальные клетки штамма Г1-774 получают аэробным культивированием штамма в среде (рН 7,2), содержащей глюкозу

1i,, пептон 0,5i, дрожжевой экстракт

0,34 солодовый экстракт С,3„ и сульфат железа (III) 7 Н 0 0,054, и промыванием полученных клеток О,С5 М фосфаT lblM буфером. Клетки диспергируют в 0,05 М фосфатном буфере (pH 7,7) в темном месте с получением бактериального раствора концентрацией

22,72 мг/мл.

По 1 мл каждой клеточной суспензии загружают в стальные реакторы на 50 мл и добавляют 24 мл 0,05 M фосфатного буфера (рН 7,7). Результирующую клеточную суспензию облучают источником света, использованным в прио . мере 1 при O С в течение 1 или 20 ч, причем количество поступающей световой энергии регулируют показанным в с 15301 табл.4 образом с помощью фильтрата> имеющего разные оптические участки и помещенного в верхней части реактора.

К каждой клеточной суспензии, об.лученной светом, добавляют 25 мл 54

5 раствора акрилонитрила (в 0,05 М растворе фосфатного буфера, рН 7,7).

Смесь подвергают реагированию в течение 20 мин при тех же условиях светового облучения, Для сравнения реакции проводят тем же путем, но с использованием клеточной суспензии без светового облучения или при облучении световой энергией, меньшей 1х10 мкБ/г кл. с.

Количество акриламида, содержащееся в этих реакционных растворах, подвергают количественному анализу с помощью газовой хроматографии для 20 определения скорости реакции. Результаты приведены в табл.4.(Влияния облучения на скорость реакции гидратации) .

Пример 22. Промытые бактериальные клетки штамма IJ-774 получают аэробным культивированием штамма в среде (рН 7,2), содержащей глюкозу 14, пептон 0,5>, дрожжевой экстракт 0,3 -, ЗО солодовый экстракт 0,3 и сульфат железа (III) 7 М<0 0,054, и промывкой полученных клеток 0,05 M фосфатным буфером. Затем 40 ч. полученных клеток (содержание воды 754), 4.5 ч. акриламида, 0,5 ч. t,Å-метиленбисакриламида и 40 ч. 0,05 И фосфатного буфера (рН 7,7) смешивают с образованием однородной суспензии. К ней добавляют 5 ч. 5Ф-ного водного раство- 40 ра диметиламинопропионитрила и 10 ч.

2>54-ного водного раствора персульфата калия. Смесь подвергают полимеризации при 10 C в течение 30 мин. Результирующий кусковой гель, содержа- 45 щий бактериальные клетки, дробят на мелкие частицы и частицы полностью промывают 0,05 М фосфатным буфером (рН 7,7) с получением 100 ч. иммобилизованных бактериальных клеток, Им- 50 мобилизованные клетки обрабатывают

0,05 M фосфатным буфером (pH 7,7) с получением раствора концентрацией

3,5 г сухих клеток на литр. Раствор иммобилизованных клеток делят на две у о порции. Одну оставляют при 0 С в течение 4 ч при тех же условиях свето-. вого облучения, что и в примере 1 (выдержка на свету), а другую порцию

01 6 оставляют при 0 C в темном месте » течение 4 ч (выдержка в 1емноте).

При использовании иммобилизованных клеток в следующих составах иэ акрилонитрила получают соответственно акриламид. Скорость реакции изучают с точки. зрения количества получаемого таким путем акриламида. В случае бактерий, выдерживавшихся на свету, смесь 0,5 ч. геля иммобилиэованных клеток, 2,5 ч. акрилонитрила и 97 ч °

0,05 M фосфатного буфера (рН 7,7) облучают светом в указанных условиях о и подвергают реагированию при 0 С в условиях перемешивания в течение

20 мин (реакция при освещении). В случае выдержки бактерий в темноте эту реакцию проводят с тем исключением, что не ведут облучения светом (реакция в темноте).

В каждом из растворов после завершения реакции акриламид подвергают количественному анализу с помощью газовой хроматографии. В результате скорость реакции при освещении и выдержке на свету 20,0 U, а в случае реакции в темноте и выдержке в темноте 0,4 U так что отношение этих показателей 50,0.

Пример ы 23 и 24. Иммобилизованные клетки штамма N-774 при выдержке на свету получают на методике примера 22. 4 ч. результирующих иммобилиэованных клеток, 2,5 ч. акрилонитрила и 98,5 ч. 0,05 М фосфатного буфера (рН 7,7) смешивают и помещают в кубический сосуд из нержавеющей стали объемом 2,5 л, верхняя часть которого открыта. Смесь облучают в сосуде через открытую верхнюю поверхность (144 см2) с помощью того же ис" точника света с длиной волны 400800 нм, что и в примере 1, при световой энергии 2,48х10 мкБ/г кл, с или лампы холодного свечения мощностью 100 Вт при световой энергии

1,86х10 мкГ/г кл. с и подвергают реагированию.при 0 С и перемешивании о в течение 20 мин соответственно. Содержащийся в каждом из растворов по завершении реакции акриламид подвергают количественному анализу с помощью газовой хроматографии. Результаты приведены в табл.5,(влияние интенсивности светового облучения на скорость реакции гидратации).

Пример 25 и сравнительный пример 3. Иммобилизованные клетки

1530101 штамма N-774 получают по методике 22.

0,4 ч. полученных иммобилизованных клеток, 84.6 ч. 0,0025 M водного раствора сульфата натрия и 1,8 ч. акрилонитрила смешивают и помещают в разъемную стеклянную колбу на 1 л, имеющую часть, выполненную светонепроницаемой. Смесь в колбе облучают лампой типа Cool light с длиной волны 1О

400-800 нм и мощностью 150 Вт с расстояния 20 см от реакционного раствора (световая энергия около 7х102 мкЕ/

/г кл. с) при одновременном регулировании рН равным 8,5 добавлением

0,056 раствора гидроокиси натрия и подвергают реагированию при регулировании концентрации акрилонитрила в реакционной системе на уровне 24 постепенным добавлением 17,2 ч, акрилонитрила. Таким путем получают 10 ч. раствора по завершении реакции, который содержит 201 акриламида. Количество непрореагировавшего акрилонитрила

100 млн и менее спустя 25 ч после 25 начала реакции.

При проведении сопоставительного примера реакцию повторяют при тех же условиях, но не используют облучения светом. Реакционный раствор содержит 30 не более 1l акриламида спустя 25 ч после начала реакции.

Ссылочный пример 1. Штамм N-774 культивируют по методике примера 1.

Полученные клетки N-774 разрушают

35 при низкой температуре с помощью пресса Френча с получением клеточной суспенэии. Суспенэию подвергают обработке с целью удаления аминокислот и диализу для получения неочищенного 40 ферментного раствора в виде фракции, насыщенной 504 сульфата аммония, которая содержит белок в концентрации

3,9 белка/мл. Раствор делят на 2 порции. Одну порцию выдерживают при 10 С 4> в течение 4 ч в тех же условиях облучения светом, что и в примере 1 (выдержка на свету). Другую порцию выдерживают при 1О С в течение 4 ч в темном месте (выдержка в темноте). При ис50 пользовании неочищенного ферментного раствора в следующих составах из акрилонитрила получают соответственно акриламид. Скорость реакции изучают с точки зрения количества получаемого

55 таким .путем акриламида.

В случае бактерий после выдержки на свету смесь 2,5 ч. неочищенного ферментного раствора,2,5 ч, акрилонитрила и 95,0 ч. 0,05 И фосфатного буфера облучают светом в описанных условиях и подвергают реагированию при 10 С и перемешивании в течение

20 мин. В случае выдержки бактерий в темноте реакцию повторяют в тех же условиях, но с тем исключением, что освещение не используют, Содержащийся в каждом из растворов после завершения реакции акриламид подвергают количественному анализу с помощью газовой хроматографии. В результате количество акриламида (АА), полученного таким путем, составляет 103 мкмоль

АА/мг белка мин, в случае выдержки на свету и реакции с облучением и

102 мкмоль AA/ìã белка мин в случае выдержки в темноте и реакции без облучения, Отношение этих показателей

1.0! ° Таким образом, эффект светового облучения не наблюдается.

Ссылочный пример 2, Этот эксперимент показывает, что бактерии, не проявляющие нитрилаэной активности, но обладающие другой ферментной активностью, не испытывают изменения ферментной активности под действием светового облучения.

Промытые клетки Brevibact erium

ammoniagenes (IA11 1645) получают аэробным культивированием штамма в среде (рН 7,2), содержащей 2, глюкозы, 0,5б "фумарата натрия, 0,2 мочевины, 0,2 двуэамещеннокислого фосфата калия, 0,051 сульфата магния ° 7 Н О и 1 раствора после замачивания кукурузы. Клетки диспергируют в 0,05 M .фосфатном буфере (рН 7,7) в темноте для получения суспензии клеток, имеющей концентрацию 30,0 ОД„, мкм, Бактериальный раствор делят на две порции. Одну оставляют при 30 С в течение 1 ч на расстоянии 20 см от лампы

Cool Beam мощностью 150 Вт при свето1 вой энергии 7х102 мкЕ/г кл. с (вы держка на свету). Другую порцию оставляют при 30 С в течение 1 ч в темноте (выдержка в темноте). При исполь" зовании этих бактериальных растворов в следующих составах из фумаровой кислоты получают яблочную кислоту.

Скорость реакции изучают в сопоставлении с количеством получаемой таким путем яблочной кислоты, В случае бактериального раствора после выдержки на свету смесь 50 ч. полученного бактериального раствора>

1530 i

8 ч. фумара а натрия и 42 и. 0,05 M фосфатного буфера (рН 7,7) реагируют при 30"С и перемешивании в течение

1 ч в описанных условиях облучения, В случае бактериального раствора после выдержки в темноте реакцию проводят в тех же условиях, но при отсутствии освещения. Фумаровую кислоту осаждают добавлением 2N НС! и удаляют 10 из раствора после завершении реакции, после чего содержание яблочной кислоты в каждом из растворов после завершения реакции определяют цветопроявительным методом с использованием 2,7- is нафталиндиола. В результате количество яблочной кислоты 3,40 мкмоль/ОД ч в случае реакции и выдержки на свету, и 3,36 мкмоль/ОД в случае реакции и выдержки в темноте. Отношение показа" телей 0,95. Таким образом, эффект светового облучения не наблюдается.

Пример ы 26-28. Осуществляют способ согласно примерам 2-13 за тем исключением, что применяют другой тип нитрилов и количество используемых нитрилов составляет 2,5 ч.

Полученные результаты показаны в табл.6 (получение амидов из нитрилов).

Использование способа позволяет 30 интенсифицировать процесс гидратации при использовании его в промышленном масштабе, формула и зоб ретения

1. Способ получения амида путем гидратации исходного нитрильного соединения суспензией грамположительных микроорганизмов, обладающих нитрилаз- 40 ной активностью, при температуре 020 С и рН 6-9 с последующим выделением целевого продукта, о т л и ч а юшийся тем,, что, с целью ускорения способа, суспензию микроорганиз- 45 мов подвергают воздействию световой энергии в количестве не менее 1 х х10 мкЕ/г кл.с с длиной волны 200800 нм до и/или после контактирования их с нитрильным соединением, при этом реакцию гидратации ведут в сосуде, 10

Таблица 1

Исходный нитрил,мас,ч.

0,05 М фосфатный буфер, мас.ч.

Пример

1,г

98,912

99,662

98,912

99,7Е7

98,912

9Е,9!2

98,912

9",912

98,912

Ацетонитрил 1

Метакрилонитрил

Валеронитрил 0,25

Цианопиридин 1

Бензонитрил 0,125

Пропионитрил 1 н-Бутиронитрил 1

Малононитрил 1

Сукцинонитрил 1

Фумаронитрил 1

Хлорацетонитрил 1

)--Гидроксилпропионитрил 1

98,912

П р и м е ч а н и е. Количество бактериальных клео С,088 ас.ч. рН 7,7. состоящем по меньшей мере час1ично из материала, не пропускающего сне1.

2. Способ по и,1, о т л и ч а ю шийся тем, что воздействуют световой энергией в количестве не менее

2x10 мкЕ/г кл. с.

3, Способ по п.1, о т л и ч а ю шийся тем, что используют суспензию штамма N-774 рода (:orynehacterium. штамма N-776 рода Nocardia, штамма

CBS-494 рода Ilacillus, штамма CBS-496 рода Bacteridium, штамма CBS-497 рода

Hicrococcus или штамма CBS-7)7 рода

Brevibacterium, 4, Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве нитрильного соединения используют ацетонитрил, пропионитрил, н-бутиронитрил, п-бутиронитрил, н-валеронитрил, акрилонитрил, метакрилонитрил, бензонитрил, цианопиридин, малононитрил, сукционитрил, фуранонитрил, хлорацетонитрил, Р -гидроксипропионитрил, аминоацетонитрил или Р-аминопропионитрил.

1530101

Таблица 2

Выдержка на светуреакция при облучении (V) Отношение показателей для двух режимов

Выдержка в темноПолучаемые амидные соединения

Примеры те-реакция в темноте (v) 6,3

44,5

56,4

289,0

9,0

6,5

Таблица 3

При- Род используемых бактерий Штаммы меры

Выдержка на свету - реакция при облучении

Отношение

Выдержка в темнопоказателей для те - реак" двух режимов ция в темноте. (U) IU) CBS-494

CBS-496

CBS-497

CBS-717

N-775

2,6

1,S

2,2

62,8

12,0

21,8

59,6

27,5

1,7

2,7

57,0

108,4

61,8

106,8

33,0

Bacillus

Bacteridium

Micrococcus

Brevibacterium

Nocardia

Т а б л и ц а 4

Примеры и сравнительные примеры

Подаваемая световая энергия, мкЕ/г кл. с

Скорость реакции после облучения

20 ч (U) Скорость реакции после облучения в течение 1 ч (v) 7,8

13,4

31 6

0,29

2,4

1х10 2.

2x10-2

1х10

5х1 0-з

9,7

17,0

34,0

0,29

3,6

Таблица 5

При- Подаваемая световоя меры энергия, мкЕ/г кл. с

Скорост ь реакции (v)

6,7

31,9

23 2,48 х 10

24 1,86 х !О

Исходные нитрильное соединение

Ацетонитрил

Метакрилонитрил

Валеронитрил

Цианопиридин

Бензонитрил

Пропионитрил н-Бутиронитрил

Малононитрил

Сукцинонитрил

Фумаронитрил -Гидроксипропионитрил

Хлорацетонитрил

Ацетоамид

Метакриламид

Валерамид

Никотинамид

Бензамид

Пропиоамид н-Бутиламид

Малонамид

Сукцинамид

Фумарамид

-Гидроксипропиоамид

Хлорацетамид

20,6

82,2

14,2

16,4

12 3

102,0

220,0

119,0

343,0

61,1

2,0

1,8

0,7

5,6

0>7

3,5

5,7

4,1

10>2

1,5

10,3

45,7

20,2

2,9

17,6

29,4

38,9

29,0

33,6

40,7

1530101

Таблицаб

Реакции Реакция с без

Примеры

Исходное нитрилсоединение

Полученные амид. соединения

Реакции с облучением светом света

26 Изобутиронитрил

25 7

18,3

Редактор О.Спесивых Техред Л.Сердюкова Корректор М.Пожо

Заказ 77Ь7/59 Тираж 501 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, )i(-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина,101

27 Аминоацетонитрил

28 )3-Аминопропионитрил

Изобутирамид

Аминоацетамид

/Ь-Аминопропионамид

7,2 0

185 7,2

220 12,0

Способ получения амида

Патент 1530101