Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus - продуцент моноклонального антитела к фактору некроза опухолей - альфа человека

Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus - продуцент моноклонального антитела к фактору некроза опухолей - альфа человека

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится гибридомной технологии и может быть использовано для определения и иммуносорбции фактора некроза опухолей-α человека (ФНО-α). Цель изобретения - получение штамма, продуцирующего моноклональное антитело к ФНО-α изотипа G2B с повышенным титром в асците. Штамм 7G 1 получен путем иммунизации мышей линии BALB/C рекомбинантным ФНО-α. Далее гибридизуют клетки селезенки иммунных мышей и клетки миеломы мыши Х63-AG8-653 и затем проводят селекцию и клонирование. Полученный штамм депонирован под номером ВСКК(П) N 172D. Штамм продуцирует монАТ JGG2B, специфичность - ФНО-α. Титр асцита превышает 1:1000000. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

„„SU > 0

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СОИДЕТЕЛЬСТВУ б:;, . ЗМ

Ф? м ?. ЮНА

1 Р ? е:.<

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

flO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4352389/31 — 13 (22) 29. 12. 87 (46) 23.12.89 Бюл. Р 47 (71) Белорусский научно-исследовательский институт переливания крови и Институт молекулярной биологии

АН СССР (72) А,B.Панютич, Н.Н.Вог?тенок и P.Ë.Турецкая (53) 578.085.23(088.8) (56) Lian! С.М. et a1,Biochem.Biophys.

Res.Comm, 1986, v 137„ р.847-85 (54) ШТАЖ1 ГИБРИДНЫХ К" 1ЬТИИГРУ1 ".NX

КЛЕТОК жИВОтНЫХ mSW

Изобретение относится к гибр.-?домной технологии и может быть ? пользовано для определения и иммуносорб.?ии фактора некроза опухолей-п человека (ФНО- oC,).

Цель изобретения — получение штамма, продуцирующего моноклональное антитело к ФНО- М, изотипа G2b с повышенным титром в асците.

Штамм получают следующим образом.

Мышей линии BaLb/c иммунизируют по двухнедельной схеме. 20 мкг рекомбинантного ФНО-о< (Р ФНО- о<.) в 0,15 М

NaCI в смеси с равным объемом пс:янов го адьюванта Фрейнда дваждь? вчодят внутрибрюшинно с интервалом в . дней, За 3, 2 и 1 день до сг?ияния 10 мкг Р (11 4 С 12 15/00, А 61 К 39/395 (57) Изопрете???ле отное ?т< гибрид нои техно ., гни и может бьг, — использоВано для оп? еде?!

G2b с повьппенным титром в асците.

Г1тамм 7С1 получен путем иммунизации

? .<.?шей:??нии Вз1.Ь / рекомбинантным

<1 i?0--,»: . Пал е г? б, ияи..: .ю ?<лс тки селе<ен сг? иммунн,л ?л?,п«й и к?етк!< .?Heëoèû мьпп?л Х63- <<-; 8-: 53 и з . <..и провог?ят се<не?;ц?ъ<? < к ?,>ч;<р,>ва???е,, o;òv÷ ?<ньпл

/ 1Т шта?г?? д<?Io?! .<рован под Н< мером БС< К(П)

17 T), Штамм г одуцирует монАТ а l

Я

?р< Ь, сп< ци p!? ??«>o г — ФНО- -, Титр

-с?-,ита превышает I: 10000< О. 2 табл, lemL

ФНО-; звог?ят внутрибрюши??но ь 0,5 мл ЯД

О. 15 <1 Ча<.1 Гиб-.я?пг? .a?????<? 1,2х10

1 клс. <с;к слезеHKH мму;?ных мьппе?л и

-,х <0 клеток м?л.ломы мьппи Х63-Аув-653 «ау проводят 50,,-???<л раствором г?олиэтиленгликоля мол.массы 000, содержащего 5 . ;.иметилсульфокс??да, в течение

1, 5 мин. После ".,!.ридизации и отмь?вKH oò полнэтиленгликоля клетки высеГ вают в 96-лу??оч??г?е панели па 1 х 10 спленоц<лтов в ?у??ку. Для культивирова?<и?я и селекции гибридом используют йь среду I_#_?. 1 (модифиц.?рованная Iskove s

c, да Дул?.бек«.о1 с добавлением 107 эмбриональной телячъеи сыворотки (ЭТС), 10 И гглпоксантина, 4 х 10 М аминопте-Ф рина и " 6 х 1 > «11 тими: ина. Гибридные

1530638 продуценты кло,»I i.ют раза ме ол .и конечных разведений. высекая по 1

4. клетке в лунку, содержащую 4 х 10 клеток селезенки. После двух клониро5 наний практически 100 субклонов продуцируют AT к P ФНО- oi Продукция антитела сохраняется как минимум в течение 15 пассажей в культуре.

Полученный штамм 7Г 1 депонирован под номером ВСКК(П) Ф 172D и характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки. Стандартные условия культивирования, Среда

IMDM с 10Х донорской телячьей сыворотки, 2 х 10 И L-глутамина, 100 мкг/мл

Ф пенициллина, 100 мкг/мл стрептомици-4 на, 0,05 х 10 ll меркаптозтанслз, при 37 С и н атмосфере 57 СО„., 1II÷ выращивания штамма испсльзуют стеклянную посуду, посевная доза 100-200 тыс, клеток на 1 мл, кл тки пассируют 1 раз в 2-3 дня,кратность рассена 1:6-1;8„

Культура суспензионная °

Культивирование рганизме живот- 25 ных. Для выращивания а цита пригодны мьппи BALB/ñ.,1ышам за -30 дней до инъекции клеток шт; а вводFIT внутрибрюшинно по 0,5 мл прис" ан», Квот,:и инъецируют нну грибрюшин « и,; 2-5 х х 10 клеток ь 1 гл среды .LlfD1!. Лсцит формируется через 12-14 дней, Биосинтез полезног;1 продуIIга„Секреция моноклональног- антитела (ИНАТ, на 2-3 день культивг ронания состанля35 ет 25-30 мкг/мл культура.II;IInI3 реды и 7 — 8 мг в 1 мл »IIII ной ж д о ти при определении иммун,»>-.рментцыч . 1 годом.

Характеристиь.а по тученного продукта. Штамм продуцирует моноклональное 40 антитело IgG2b. Специфичность — ФНО-о .

Иетоды оценки сохранения специфичности; тест на связывание с иммобилиэованным ФНР.-О4(иммунг ферментный анализ). 45

Антиген сорбируюг на плзсгпк .

500 нг в 50 мкл 0,1И бикарбонатного буфера, рН 9,6, ночь при 4 С. Затем о, после отмывки наносят тестируемую культуральную среду и после инкуба50 ции и отмывки определяют количество сорбированных антител меченньггн пероксидаэой кроличьими антимьипиннми антителами. Все отмывки проводят бидистиллированной водой. Контролем служит

55 бычий сывороточный альб}ж . н качест- ве антигена.

Стабильность пр< дукции. Продукция монАТ сохраняется как минимум до 15 пас«, и i» 1г о. В асц штамм не влссироналс я бол. п :n""n раза.

Контаминация, Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микоплазмой не выявлено при окрашивании красителями на ДНК и по характеру включения тимидиноной метки.

Криоконсервиронание, Для длительного хранения клетки штамма замораживают н эмбриональной телячьей сыворотке с добавлением 107 диметилсульфоксида. Режим замораживания: 1 С/мин о до -70 С. После замораживания клетки переносят в жидкий азот. Размораживание на водяной бане при 37 С. Жизнео, способность клеток после размораживания 65-707. по окрашиванию трипановым синим.

Пример 1. Гибридомцые клетки помещают н стеклянньп флакон объемом

50 мл по 1 х 10 клеток в 5 мл среды б с 107. ЭТС, 2 мИ сь -глютамина, 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина. 0,05 м | меркаптоэтанола, Клето ки культивируют 2-3 дня при 37 С в атмосфере .",, . СО . Полученный супернатант используют н качеств» ppагpнта в иммунохпмическпх реакпцях (как репарат монАТ).

Тест н» определение специфичности нзгимодействия МоНАТ с ацтигенами, иммобилизонанными на пласгик», Нспользуеиый метод: нм.:уноферментный анализ.

Р ФНО- К, Р ФНО- и бычий сывороточный альбумин (БСА) в количестве

0,5 мкг н 50 мкл 0,1 M карбонатного буфера рН 9,6, вносят в лунки 96-ячеечных микроплат и сорбируют ночь при

4 С. После отмывок в ячейки вносят по 50 мкл культуральной среды штамма

761 или разведенных 1:5000 н 0,01 И фосфатном буфере, рН 7,4, 0,15 И

ИаС1, 17 БСА (ЗФР-БСА) поликлональных кроличьих антител, специфичных к Р ФНО- о4 . Панель инкубируют 2 ч при

20 С, затем отмывают 5 раз бидистиллированной водой и вносят по 50 мкл/лунку кроличьи противомышиные антитела. меченные пероксидазой, разведенные

1/2500 н ЗФР-БСА, и меченные пероксйдазой протинокроличьи антитела 1/2500 в ЗФР-БСА, После инкубации в течение

1 ч при 20 С плату отмывают и в лунки

15306 добавляют субстрат — ортофенилендиамингидрохлорид, 0,6 мг/мл в цитратно- . фосфатном буфере рН 4,7, содержащем

0,03 Н, О, Реакпию останавливают через 10 мин 1 М серной кислотой и учитывают на спектрофотометре с вертикальным лучом при длине волны

492 нм.

Результаты опыта по изучению специфичности связывания монАТ, продуцируемогс клетками штамма 7С1, с антигенами, иммобилизированными на пластике, представлены в табл.1.

Результаты этого примера свидетель-15 ствуют о высокой специфичности монАТ, вырабатываемого клетками штамма 7G1, и показывают возможность применения этого монАТ для определения P ФНО- < с помощью иммуноферментного метода. 20

38 б в плоскодон> е 96-я тесаные михроплаты в полной среде ДМЕМ. Образцы ФНО >аститровывают в отдельном планшете в объеме 100 мкл, затем переносят в плату с,клетками 1929, добавляют актиномицин D до концентрации 1 мкг/мл н помещают в термостат с температурой

37 С на 16-20 ч. Результаты учитывают после окрашивания клеток 0,2 -ным раствором генцианвиолета в 2 -ном метаноле в течение 10-12 мин ° Оптическую плотность лунок измеряют при длине волны 540 нм на спектрофотометре с вертикальным лучом. Лизису клеток 1929 соответствует снижение оптической плотности лунок.

Результаты опыта по сорбции Р

ФНО- oL монАТ штамма 7С1 представлены в табл.2.

Штамм гибридных культивируемых клеток животных MusmuscuIus BCKK(H)

У 172D — продуцент моноклонального антитела к фактору некроза опухолей— альфа человека.

Данные табл.1 показывают, что монАТ 7С1 из культуральной среды гибридомы взаимодействуют с ФНО- о,практически одинаково с кроличьей антисывороткой в разведении 1:5000 (2563 и 2584 соответственно). Специфичность связывания монАТ с ФНО-Ы при этом выше, чем у поликлональных антител (по отношению к связыванию с БСА и ФНО- p ) . 30

Пример 2. Сорбция Р ФНО-с монАТ штамма 7GI, К 1 мл Бра-сeфapoзы 4В добавляют

1 мл кроличьей антисыворотки к иммуноглобулинам мыши и инкубируют I ч при комнатной температуре. Несвяэавшиеся антитела отмывают 0,05 М трис-НС1, 0,15 М ИаС1,, рН 7,4 (ТБР) путем многократного центрифугирования, 0,3 мл полученного сорбента смешила- 40 ют с 5 мг сульфатной фракции асцита гибридомы 7G1, инкубируют на горизонтальной качалке 1 ч при комнатной температуре, заполняют гелем микроколонку из пастеровской пипетки и промы- 45 вают ее ТБР. Образцы P ФНО- о и

P ФНО- Р готовят на минимальной среде, модифицированной Дульбекко (ДМЕМ) с 5Х 3ТС, глютамином, меркаптоэтанолом, пенициллином и стрептомицином 50 (полная среда ДМЕМ). 0,5 мл образца пропускают через колонку в течение

15 мин, затем собирают и стерилизуют фильтрацией.

Биологическую активность факторов определяют по лиэису клеток мьш;иной фибробластоидиой линии 1929 в присутствии актииомицина Д. Накануне теста клетки 1929 рассевают по 50 тыс,/лунку

Оптическая плотность окрашенных интактных клеток 1290.

Из данных табл.2, следует, что пропускание через колонку с монАТ

7С1 образца ФНО- сС, приводит к потере его цитотоксической активности, что подтверждает специфичность монАТ и возможность их применения для иммуносорбции.

Пример 3. Опр.=деление проводят в соответствии с примером 1, но вместо культуральной среды штамма

7G1 в лунки с сорбированным ФНО вносят соответствуюшие разведения асцита 7С1 на ЗФР-БСА.

Результаты показывают, что при разведении асцита 1:1000000 оптическая плотность в ИФА (А492х10 ) составляет 380 и, таким образом, титр асцита превышает 1: 1000000.

Использование гибридомы 7G1 позволяет получать монАТ изотипа С2Ь,что создает преимущества по сравнению с монАТ иэотипа С! при очистке на аффинных колонках с протеином. А золотистого стафилококка, а также создает возможность экономии асцита при определении ФНО.

Формула изобретения

1530638

Таблица 1

Культуральная среда штамма 7С!

А492 х10

Антигены.м

+А492 — оптическая плотность лунок при 492 нм.

Таблица 2

Фактор некроза опухолей

Рекомбинантный ФНО- Ф

Рекомбинантный ФНО-(3

Составитель А.Маныкин

Редактор Н.Гулько Техред M.дидык - Корректор N.Ïîùî

Заказ 7863/27 Тираж 501 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

БСА

ФНО-

ФНО-

2563

131

До сорбции, А540 х 10

316

Кроличья антисыворотка 1:5000

А492 х10

291

2584

481

Сорбция монАТ шт амма 7 С 1, А540 х 10

447