Способ определения лимфоцитарных антигенов и антилимфоцитарных антител в сыворотке крови

Способ определения лимфоцитарных антигенов и антилимфоцитарных антител в сыворотке крови

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для выявления лимфоцитарных антигенов и антилимфоцитарных антител. Цель - упрощение повышения точности способа. Идентификация лимфоцитарных антигенов и антилимфоцитарных антител осуществляется путем определения степени снижения времени жизни медленного компонента (Τ<SB POS="POST">M</SB>) триптофановой фосфоресценции при комнатной температуре (ТФКТ) лимфоцитов после их обработки тест-реагентом или исследуемым субстратом. Способ включает выделение лимфоцитов, их обработку исследуемой или стандартной сывороткой крови или иным субстратом, облучение образцов, из которых предварительно удален кислород ультрафиолетовым светом в диапазоне 250-300 нм и определение Τ<SB POS="POST">M</SB> ТФКТ. Снижение ТФКТ на 8% и более обработанных лимфоцитов свидетельствует о наличии тех или иных лимфоцитарных антигенов или антилимфоцитарных антител.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (191 1111 (51) 4 С 01 М 33/50

ВбЕйОЫНАЯ

q-, @ ÖÍà

ИЕ-1 Ез, А

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ тител.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4346742/28-14 (22) 21.12 ° 87 (46) 30.12.89. Бюл. 11 48 (71) Белорусский научно-исследовательский институт переливания крови и Институт фотобиологии АН БССР (72) В.И.Левин, Е.С.Лобанок, В.M.Ìàæóëü, С,В,Конев, А.И.,Свирновский и Г.В.Семенов (53) 612.015(088.8) (56) Terasaki,Р., Месlеllапоl J.

Microdrop1et assay of human serum

cytotoxing. - Nature, !964, ч. 204, р. 998, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИМФОЦИТАРНЫХ АНТИГЕНОВ И АНТИЛИМФОЦИТАРНЫХ

АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (57) Изобретение относится к медици- не и может быть использовано для выявления лимфоцитарных антигенов и антилимфоцитарных антител. Цель — упИзобретение относится к медицине и касается способов идентификации антигенов на поверхности лимфоцитов и антилимфоцитарных антител в среде.

Цель изобретения — упрощение способа и повышение точности определения.

Способ осуществляется следующим образом.

Из периферической крови или какого-либо лимфоцитарного органа выделяют лимфоциты, на градиенте фиколлверографина. Клетки дважды отмывают изотоническим раствором (средой 199» средой Хенкса, забуференным физиоло2 рощение повышения точности способа.

Идентификация лимфоцитарных антигенов и антилимфоцитарных антител осуществляется путем определения степени снижения времени жизни медленного компонента (Е;„) триптофановой фосфоресценции при комнатной температуре (ТФКТ) лимфоцитов после их обработки тест-реагентом или исследуемым субстратом. Способ включает выделение лимфоцитов, их обработку исследуемой или стандартной сывороткой крови или иным субстратом, облучение образцов, из которых предварительно удален кис" лород, ультрафиолетовым светом в диапазоне 250-300 нм и определение

ТФКТ. Снижение ТФКТ обработанных лимФоиитов íà 8Х и более свииетельствтет Q) о наличии тех или иных лимфоцитарных антигенов или антилимфоцитарных ан- ( гическим раствором хлористого натрия) и готовят их взвесь с концентрацией (6-8) 10 клеток в 1 мл (концентрация клеток зависит от чувствительности используемого Т-фосфориметра). К

1 объему взвеси лимфоцитов добавляют равный объем исследуемого субстрата или тест-сыворотки (тест-сыворотка— реагент, содержащий антилимфоцитарные антитела определенной специфичности). Суспензию лимфоцитов перемешивают и инкубируют при 37 С 30 мин.

По окончании инкубации клетки однократно отмывают изотоническим раствором и ресуспендируют в объеме 0,4 мл

1532873 этого же раствора. В контрольную пробу вносят иэотонический раствор.

После удаления кислорода иэ суспензии лимфоцитов в образце воэбуж5 дают триптофановую фосфоресценцию путем облучения в течение 3-5 с ультрафиолетовым светом спектрального диапазона 265-300 нм, после прекращения облучения регистрируют кинетику эату- 10 хания ТФКТ в цифровой или аналоговой формах. Путем обработки результатов регистрации кинетики затухания ТФКТ лимфоцитов опытной (Гм,о)и контрольной (м,к) проб определяют Г, „и 7 „„ и на ос- 15 новании сравнительного анализа полу ченных результатов (м - i: Ъ87) определяют наличие лимфоцитарных анти генов или антилимфоцитарных антител.

Пример 1. Иэ стабилизированной крови в градиенте плотности фиколл-верографина выделяют лимфоциты

1 и дважды отмывают средой Хенкса. Готовят две порции взвеси лимфоцитов с концентрацией клеток 8 ° 10 в 1 мл. К тестовой сыворотке анти-HIA-10 добавляют равный объем взвеси лимфоцитов (опытная проба). Контрольным образцом служат лимфоциты, проинкубированные в ,изотоническом растворе (растворе Хенк"30 са). После 30 мин инкубации при 37 С

,контрольный и опытный образцы одно1 кратно отмывают раствором Хенкса и осадок ресуспендируют в 0,4 мл раствора Хенкса (рН 7,2). Возбуждают трип-. тофановую фосфоресценцию клеток путем облучения ультрафиолетовым светом и с помощью Т-фосфориметра определяют время жизни триптофановой фосфоресценции контрольной и опытной проб лим40 фоцитов. .я контрольного образца лимфоцитов равно 1,264 с, опытного—

0,822. Степень снижения времени жизни медленного компонента ТФКТ лимфоцитов

357,. !

Следовательно, на и"следованных лимфоцитах экспрессирован антиген

HlA-A10.

Пример 2. Иэ стабилизированной 2,7Х ЭДТА цельной крови в градиенте феколл-верографина выделяют лимфоциты, которые после их двукратного отмывания средой Хенкса делят на две порции. К тестовой сыворотке антиHlA-В41 добавляют равный объем взвеси

55 лимфоцитов с концентрацией 7 10 в

1 мл и после перемешивания инкубируют

30 мин при 37 С. Контроль — лимфоциты, проинкубированные в растворе Хенкса. По истечении времени инкубации клетки однократно отмывают и переносят в 0,4 мл среды Хенкса ° Определяют . (с помощью -фосфориметра) время жиэ ни ТФКТ лимфоцитов контрольного и опытного образцов. Время жизни д„ необработанных анти-Н1А сыворотки лимфоцитов равно 1,161 с, а обработанных

1,138 с, т.е, снизилось на 2Х. Такое незначительное изменение времени жизни медленного компонента ТФКТ лимфоцитов после их обработки анти-HlA тест-сывороткой свидетельствует об отсутствии на них антигена Н1А В41.

Пример 3. Иэ стабилизированной 2,7Х раствором ЭДТА цельной крови в градиенте фиколл-верографина выделяют лимфоциты. После их двукратного отмывания средой Хенкса готовят взвесь лимфоцитов в растворе Хенкса с концентрацией клеток 8 10 в 1 мл.

К исследуемой тест-сыворотке добавляют равный объем взвеси лимфоцитов и после перемешивания-взвесь инкубируют

30 мин при 37 С. Контрольным образцом служат клетки, проинкубированные в растворе Хенкса. После инкубации оба образца однократно отмывают средой

Хенкса. 0,4 мл клеточной взвеси используют для измерения параметров

ТФКТ лимфоцитов. C+ контрольного образца лимфоцитов равно 1,177, опытного — 0,532. Следовательно, степень снижения Г„„ обработанных лимфоцитов

54,87. Такое значительное уменьшение времени жизни медленного компонента

ТФКТ лимфоцитов свидетельствует о наличии специфического взаимодействия между клетками и антилимфоцитарными антителами, т.е. о присутствии в исследуемом субстрате антилимфоцитарных антител.

Формула изобретения

Способ определения лимфоцитарных антигенов и антилимфоцитарных антител в сыворотке крови путем приготовления суспенэии лимфоцитов и обработки суспензии сывороткой крови, о т— л и ч а ю шийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения точности определения, из суспензии лимфоцитов удаляют кислород, облучают ультрафиолетовым излучением в диа паэоне 265-300 нм, определяют время жизни медленного компонента триптом,o,í

Ла Г.— — - — — - - - 1007 8X м,к. - .м.о.н, г

4 У м.к

Составитель Е.Колмакова

Техред Л.Олийнык Корректор Э.Лончакова

Редактор Л. Веселовская

Заказ 8094/51

Подписное

Тираж 789

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,!01

5 1532873 фановой фосфоресценции при комнатной где м.к температуре (ТФКТ) лимфоцитов и определяют наличие антигенов и антител

1ри время жизни медленного компонента ТФКТ лимфоцитов, не обработанных сывороткой; время жизни медленного компонента ТФКТ лимфоцитов, обработанных сывороткой.