Способ получения пируватдекарбоксилазы из пивных дрожжей

Способ получения пируватдекарбоксилазы из пивных дрожжей

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к способам получения ферментных препаратов, а именно пируватдекарбоксилазы, и может быть использовано в микробиологической промышленности для выделения пируватдекарбоксилазы, используемой в медицинской и сельскохозяйственной практике при ферментативном определении уровня тиаминдифосфата в крови или другой биологической жидкости. Цель изобретения - повышение стабильности препарата при хранении. Из отмытой биомассы готовят суспензию для экстрагирования белкового препарата, которую обрабатывают ультразвуком с частотой 20 - 22 кГц в течение 18 - 25 мин с последующим фракционированием ацетоном и сульфатом аммония. Заключительную очистку выполняют адсорбционной хроматографией на оксиапатите и ионообменной хроматографией на КМ-целлюлозе. Стабилизацию белкового препарата осуществляют внесением к гомогенной пируватдекарбоксилазе 2 - 3 М сульфата аммония и 0,01 -0,05 М сульфата магния в @ 0,02 - 0,1 М NA-фосфатном буфере, PH 6, 8 с лиофилизацией суспензии при -35°С. Лиофилизированный порошок хранят в плотно закрытых тюбиках при -15°С. Выход высокоочищенной пируватдекарбоксилазы составляет 31% с удельной активностью 64,8 Е на 1 мг белка. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 И 9/88

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

11

|

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21 ) 4362905/31-13 (22) ) 2.01.88 (46) 07.02.90. Бюл. Р 5 (71 ) Институт биохимии AH БССР (72) И.П.Черникевич, Э.А.Гриценко и В.В.Баум (53 ) 577 ° 1 5 ° 07 (088 ь 8 ) (56) Allrich J. Yeast Pyruvat e

Decarhoxylase 12-ОхоасЫ СагЬоху-, Lyase, Е С 4.1.1,1, Assay of

Thiamin Pyrophosphate, Methods

in Enzymology, 1970, vol. 18 А, р. 109-115.

Sieber М., Konig St., НиЬпег G. /

Бсnillenberger А, А ВарЫ: Procedure for *he Preparation of Highly

РигЫ1ей Pyruvate Decarboxylase

from Brewer s Yeast Biomedica . Biochimica, Acta, 1983, vol. 42, У 4, р. 343-349. ! (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПИРУВАТДЕКАРБОКСИЛАЗЫ ИЗ ПИВНЫХ ДРОЖЖЕЙ (57) Изобретение относится к способам получения ферментных препаратов, а именно пируватдекарбоксилазы, и может быть использовано в микробиологической промышленности для выделения пируватдекарбоксилаИзобретение относится к способам получения ферментных препаратов, а именно пируватдекарбоксилазы, и может быть использовано в микробиологической промышленности для получения пируватдекарбоксилазы, используемой при ферментативном определении уровня тиаминдифосфата в

2 зы, используемой в медицин" êîé и сельскохозяйственной практике при ферментативном определении уровня тиаминдифосфата в крови или другой биологической жидкости. Цель изобретения — повышение стабильности препарата при хранении. Из отмытой биомассы готовят суспензяо для экстрагирования белкового препарата, которую обрабатывают ультразвуком с частотой 20-22 кГц в течение 18-25 мин с последующим фракционированием ацетоном и сульфатом аммония. Закпочителъную очистку выполняют адсорбционной хроматографией на оксиапатите и ионообменной хроматографией на К11-целлюлозе.

Стаб илизацию б елков ого препарата осуществляют внесением к гомогенной пируватдекарбоксилазе 2-3 М сульфата аммония и 0,01-0, 05 M сульфата магния в 0,0?-0,1 М На-фосфатном буфере, рН 6,8 с лиофилизацией суспензии при -35 С, Лиофилизированный порошок хранят в плотно закрытых тюбиках при -15 С. Выход высокоочищенной пируватдекарбоксилазы . составляет 31Х с удельной активностью 64,8 E на 1 мг белка,2 табл, крови или другой биологической жидкости человека и животных.

Цель изобретения — повышение стабильйости препарата при хранении.

Способ осущес твляют следующим образом.

1541255

Берут свежую пастообразную массу пивных дрожжей Saccharomyces carlshergensis 7-9 регенераций и готовят суспензию для экстрагирования белко5 ного препарата. Приготовленную суспензию обрабатывают ультразвуком с част. отой 20-22 кГц в течение 1825 мин и проводят фракционирование ацетоном и сульфатом аммония.

Затем выполняют адсорбционную хрома тографию на оксиапатите и иоиообмен1 ную хроматографию на KM-целлюлозе, 1 добиваясь очистки пируватдекарбоксилазы до гомогенного состояния. Стабилизацию белкового препарата осуществляют добавлением к гомогенной пируватдекарбоксилазе 2-3 М сульфата аммония и 0,01 -0,05 M сульфата ,магния в 0,02-0,1 M Иа-фосфатном буфере, рН 6„8 с последующей лиофилиэацией суспензии при -35 С, Лиофилизированный порошок хранят в плотно закрытых тюбиках при -15 C.

Наилучший эффект достигается при обработке суспензия дрожжей ультразвуком с частотой.20-22 кГц в течение 18-25 мин и добавлении к

/ гомогенному препарату 2-3 М сульфата аммония и О, 01 -О, 05 M сульфата магния в 0,02-0,1 М Иа-фосфатном буфере, рН 6,8 . Уменьшение частоты ультразвука ниже 20 кГц или времени обработки суспензии менее 18 мин ведет к недостаточному разрушению клеток (неполный выход продукта), а увели-! чение частоты ультразвука свыше ,22 кГц или времени обработки более

25 мин — к частичному разрушению пируватдикарбокс илазы.

Снижение молярности Na-фосфатного буфера ниже 0,02 М и уменьшение концентрации сульфата аммония ниже

2 М и сульфата магния менее 0,01 М в исходном Na-фосфатном буфере вецет i< сниженыо стабильности препарата. Стабильность белкового препарата уменьшается в таком случае от 2 до 5 раз. Увеличение молярности Na-фосфатного буфера свыше 0,1 M а также концентрации сульфата аммо- ния более 3 М не приводит к повышению эффекта по сравнению с применяемыми молярностью буфера или концент1)ациями соли. Сульфат магния в концентрациях свьппе 0,05 M способствует

:ннак тивации фермента.

Пример . Берут 5 кг свежих пивных дрожжей Saccharamyces саг1зЪегgensis 7-9 регенераций. Свежую дрожжевую массу многократно промывают холодной водой и центрифугируют

15 мин при 5000g. Полученную пастообразную массу дрожжевых клеток используют для приготовления суспензии и экстрагирования белкового препарата ° С этой целью 400 r дрожжевых клеток смешивают с 1750 мл воцного раствора, содержащего 67 мл глицерина, 0„668 г ЗДТА, 13,2 r

NagHP0q. и 2,8 г (NH„) SO

Приготовленную суспензию интенсивно перемешивают в течение 10 мин.

Интенсивно перемешанную суспензию охлаждают до -2 "С и обрабатывают ультразвуком при частоте 2? кГц в течение 20 мин, добиваясь полного разрушения клеток, способствующего максимальному выходу конечного продукта. Полученный экстракт центрифугируют в,течение 30 мин при 4000g, а затем в течение 1 ч при 105000g.

Осевшие после центрифугировакия субклеточные фракции удаляют, а к надосадочной жидкости при непрерывном перемешивании приливают охлажденный до -20 (: ацетон до 37,5F.— ного насыщения, не допуская нагревания раствора выше (1 С. После выдерживания 15 мин при этой температуре суспензию центрифугируют в течение

5 мин при 4000р; и осадок отбрасывают. На кажцые 100 мл надосадочной жидкости повторно приливают по 10 мл ацетона и доводят температуру раствора до -2 (;. Через 15 мин экстракт центрифугируют, а конечный осадок быстро суспендируют в 400 мп 0,02 М трис-НС1 буфера. рН 7,3 с 1 мМ ЭДТА и 5 мМ цистеин-гидрохлоридом и перемешивают. После перемешилания в течение 30 мин при 0 C однородный бегпсовый раствор подвергают фракционированню сульфатом аммония, добавляя 108 r сухого измельченного (NH,) БО„. Через 1 ч смесь центрифугируют, осадок отбрасывают, а на каждые 100 мл надосадочной жидкости вносят по 7 г сульфата аммония (44-537.-ное насыщение) в течение

20 мин при перемешивании. Высоленный белок собирают центрифугированием. На данной стадии активность пируватдекарбоксилазы достигает 8,3 Е, однако присутствующие в препарате незначительные остаточные концентрации НАД Н-зависимых оксидаз приво1541 255 дят к самопроизвольному окислению

НАЛ Ка.

Заключительную очистку проводят методами адсорбционной хроматографии на оксиапатите и ионного обмена на

KM-целлюлозе. Для достижения гомогенности 1 r грубой сульфо-аммонийной пасты растворяют в 1,5 мл

0,005 M Na-фосфатного буфера, РН

6,8 с 2 мМ Mg, 1 мМ ЭДТА, 0 5 мМ тиаминдифосфатом и 5 мМ цистеингидрохлоркдом и пропускают через колонку (3,6 30 см, 48 мл/ч) с сефадексом С-25, уравновешенную исходным буфером. Значение РН и ионной силы уравновешивающего буфера подобраны экспериментально, при которых пируватдекарбоксилаэа не связывается оксиапатитом и обнаруживается в первых же фракциях элюирующего раствора, тогда как сопутствующие примеси все еще эффективно удерживались на носителе. Обессоленный белковый элюат смешивают с трехкратным объемом уплотненного осадка оксиапатита, уравновешенного этим же буфером, после экспозиции в течение 10 мин при 4 С центрифугируют в течение

5 мин при 10000g. Адсорбент повторно промывают 3 мл буфера, надосадочную жидкость объединяют> РН доводят

20 мИ ацетатом Na с 80 мМ Иа-фосфатом до 5,06 и наносят на колонку (2,1Х20 см) с КМ-целлюлозой. Пируватдекарбоксилаза не связывается катионообменником и элюируется Naацетатно-фосфатным буфером (20 и

80 мМ соответственно ), РН 5, 06 в пустом объеме колонки со скоростью

36 мл/ч. Объем фракций 2 мл. После десорбции белка значение РН элоата увеличивается до 6,5, добавляя к фракциям по 1 мл 1 M фосфата Иа, РН 6,8. Результаты всех стадий очистки суммированы в табл. 1, Стабилизацию пируватдекарбоксилазы осуществляют сульфатом аммо +. ния в присутствии ионов Mg . К белковому элоату, содержащему 3 мг белка в 1 мл,.добавляют при перемешивании сульфат аммония и сульфат магния в 0,05 И 11а-фосфатном буфере, РН 6,8 до конечной концентрации компонентов 2,7 и 0,02 M соответственно, после чего замороженную суспенэию лиофилизируют на установке для сублимационной сушки при температу.о 2 ре -35 С и давлении 6 10 Па. Лиофилизированный порошок хранят в плотно закрытых тюбиках при -15 С. Все операции по выделению и очистке пируватдекарбоксилазы проводят при

+4 С.

Пример 2. Подготовку исходного материала, приготовление суспензии для экстрагирования белка с обработкой ее ультра звуком, проведение ацетонового и аммонийного фрак ционирований и заключительную очистку белкового препарата до гомогенного состояния проводят аналогич-. но примеру 1. Стабилизацию пируватдекарбокеилазы осуществляют сульфатом аммония в присутствии ионов Мя

К белковому элюату, содержащему 3 мг белка в l мл, добавляют при переме20 шивании сульфат аммония и сульфат магния в 0,02 M Иа-фосфатном буфере,.

РН 6,8 до конечной концентрации компонентов 2 и 0,01 M соответственно, после чего замороженную суспензию лиофилизируют на установке для сублимационной сушки при температуре

-35 (, и давлении б 10 Па, Лиофилизированный порошок хранят в плотно закрытых тюбиках при -1 5 С.

30 Влияние с таб илизирующих агентов с указанной конечной концентрацией (2 М сульфат аммония и 0,01 И сульфат магния в 0,02 M Na-фосфатном буфере, РН 6,8) на активность пируватдекарбоксилазы показано в табл. 2.

Пример 3. Подготовку исходного материала, приготовление суспензии для экстрагирования белка с обработкой ее ультразвуком, проведение ацетонового и аммонийного фракционирований и заключительную очистку белкового препарата до гомогенного состояния проводят аналогично примеру 1.

Стабилизацию пируватдекарбокси45 лазы осуществляют сульфатом аммо + ния в присутствии ионов Mg . К белковому элюату, содержащему 3 мг белка в 1 мл, добавляют при перемешивании сульфат аммония и сульфат магния в

0,1 M фосфатном буфере, РН 6,8 до конечной концентрации компонентов

3 и 0 05 M соответственно, после чего замороженную суспензию лиофилизируют на установке для сублимациойной сушки пРи темпеРатУРе -35 С и давлении 6" 1() Па. Лиофилизированный порошок хранят в плотно закрытых тюбиках при -15 (., Влияние стабилизирующих агентов с указанной их

1541255

Таб лица 1

Удельная ак тивность, ед, акт./ мг белка

Степень очистки

Стадия Очистки

Белок, мг

Выход, %

HOCTb ед. акт.

Исходный экстракт

Фрак цион иров ание ацетоном

Фракционирование сульфатом аммония

Адсо рб ционная хроматография на оксиапатите

Хроматография на КМ-целлюлозе

32500 12025

3170 9820

0,37

1,0

100

3,1

8,4

954

7920

8,3

22,5 65

223

3820

23,8

64,3 44

175 1 31

64,8. конечной концентрацией (3 М сульфат аммония и 0,05 М сульфат магния в

0,1 М Na-фосфатном буфере, рН 6,8) на активность пируватдекарбоксилазы показано в табл. 2, Применение изобретения позволяет получить ферментный препарат с удельной активностью 64,8 F. и выходом 31% (см. табл. 1 ), при этом весь процесс получения пируватдекарбоксилазы занимает 8 ч.

Стабильность высокоочищенного фер мента при +4О0 в водных или буферных растворах в отсутствии и в присутствии стабилизирующих агентов, блокирующих реакционноспособные участки молекулы белка или моделирующих компартментализацию фермента в дрожже. вой клетке, показана. в табл. 2.

Как видно из табл. 2, среди агентов, защищающих реакционноспособные участки молекулы пируватдекарбоксилазы (дитиотреитол, пируват, Mp;H0 +), наибольшим стабилизирующим эффектом об- 25 ладают ионы Mg ". В среде 2,7 М сульфата аммония с 0,02 M сульфатом магния в 0,05 M Na-фосфатном буфере, рН 6,8 белок остается активным в течение месяца. Лиофилизированный с вышеуказанными компонентами препарат стабилен ири "15ОС в течение года.

Формула и зоб ре тения, Способ получения пируватдекарбок-, силазы из пивных дрожжей, включающий гомогенизацию клеток, фракционирование гомогената ацетоном и сульфатом аммония с последующей очисткой на катионообменнике в 20 мМ ацетате натрия и 80 мМ фосфате натрия с рН 5 06, отличающийся тем, что, с целью повышения стабильности препарата при хранении, гомогенизацию клеток проводят обработкой ультразвуком с частотой 20-22 кГц в течение 18-25 мин, фракционирование ацетоном — в интервале концентраций

37,5-43,2 об.%,фракционирование сульфатом аммония — в интервале 44-53% насыщения, перед очисткой на катионообменнике осуществляют очистку на оксиапатите в 0,005 М натрийфосфатном буфере с рН 6,8, ионообменную хроматографию проводят Hà KM-целлюлозе и полученный раствор фермента лиофилизуют из раствора, содержащего 0,02-0, 1 М натрийфосфатный бу-фер с рН 6,8, 2-3 М сульфата аммония и 0,01-0,05 М сульфата магния.

1541255

1 Э

1 Е

СЧ Р л

СЧ

СЧ а

»е л

1 I 1 1 1 1 I l I и

Э 1

Е

01 л

О

00 л

00 л

1 I 1 1 1 I 1 Р

Е ! сР !

U

Э I

Е

О л

СЧ

СЧ л

I 1 сч

М л

СЧ

О

1 I I I l Р л

СГ

Ch л

Ch

О л ле

° сс л л

I М

1 I I

Lh сс1

° Л Л Л л а QQ LO м1 ф. О л ф л

ОЪ СЧ

О о м л

1 !

О\ а

1 I ъ л

Ch ф а

»е

О1

О

1»

0 ло а

1» 1 и

f л л л

Сч /

О

О

О

I

1 1

1 м

1 — 4

СЧ

О

О

О

О СО л л ф О ф Ch а л л

О «» 00

СЧ л О л О

О о

О

Ф О

О\ л л л Ch «»

О

О м

О

О Р л

Ch» Ch О\

О о

О

D

О !

Ch

О ф О

cv л а ° л

М 10

К) Л Ch

О О

О О

О О

О О

О

О о

О

О л 15

I o

1 1

О 00 л а Р О ф а

Ж Ж

Р1 Р л л

% % л О л с0 а а

ДСЧО

Х +

О СЧ СЧ О СЧ

+ + + + л о

Э

Р

С0

0 л

)Е

Ж

k(0

Х

I u ! Э

Е

l 1

1 «»

1 1

1

1 а

) е

ФФ зЯ Я

О 3 g

3 8

2 0

E Й

Р а3 «б

М Р»

О) Я ц а л с0 О О

Д; О О

О О 1 . л 0 л а ° °, л л ф О1 О1

М Л СЧ СЧ N Ch

» М Ю СЧ ф СЧ л а л л ° л л

iО iР r 00

В О Л t Ch

Ж Ж !

» 0 сб

Е

1» с0 Ее

81 0! и

Х

3 и а и с0 0

3 3

Х Х

Е Я д

° 9 О ф

CJ Ж

Е

Я 1»

Сч 0 Э

О g Р л 1 qj

О И

Ж

Р1 Ж

iI:

3(6

1аа

Р1 л

Р 0 1 !

3 v и

0 Я О

1 се1

Х

X

О

Я( и

1 а

О а о